HPLC法测定红豆杉细胞培养物中的α-萘乙酸

黄巧明，骆雪兰，徐国熙，李干雄，刘志伟

广东科伦药业有限公司研发部，广东梅州 514031

萘乙酸是一种生长素类性质的生长调节剂，其毒性小，且具有明显的增产效果，因此在农业上得到广泛应用，但日本、美国对其在农产品的残留均有严格的限量。紫杉醇是从红豆杉植物中提取的一种抗癌药，由于红豆杉植物资源短缺，梅兴国等采用红豆杉植物细胞培养技术生产紫杉醇［1］，在其生产过程中添加萘乙酸对生物量具有明显的促进效果，而且在鲜细胞和培养液中的紫杉醇产量均有所增加，因此萘乙酸在红豆杉细胞培养中也作为一种调节剂。

目前，国内对萘乙酸在水稻、水果和蔬菜中的残留检测已有报道，检测方法主要有分光光度法、气相色谱法和高效液相色谱法等。本文采用了溶剂萃取前处理，高效液相色谱分离测定，分析了红豆杉细胞培养物中的萘乙酸残留状况，结果准确可靠、灵敏度高，能符合农药残留的分析要求。

1 材料与方法

1.1 仪器和试药

Waters 515高效液相色谱仪、Waters 2487紫外检测器(美国Waters公司)，UV-2401 PC紫外分光光度计(日本岛津公司)，旋转蒸发仪。

对照品:萘乙酸纯度为99%(国药集团化学试剂有限公司);乙腈为色谱级试剂;水为超纯水;二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、磷酸和磷酸二氢钾为分析纯试剂，红豆杉细胞培养液和鲜细胞由本单位提供。

1.2 样品的处理和制备

培养液样品:将鲜细胞用200目滤布过滤，滤液即为红豆杉细胞培养液。精密量取50 mL培养液，加入50 mL二氯甲烷萃取，共萃取三次，收集二氯甲烷溶液经旋转蒸发仪减压浓缩至干，用乙醇溶解洗脱并定容5 mL，摇匀待分析。

鲜细胞样品:精确称取鲜细胞10 g，加50 mL乙醇浸泡30 min，并用超声波振荡15 min，细胞用滤纸过滤，加50 mL乙醇重复超声三次，合并滤液经旋转蒸发仪减压浓缩至干，加50 mL二氯甲烷和50 mL蒸馏水萃取，共萃取三次，二氯甲烷溶液减压浓缩至干，用乙醇溶解洗脱并定容10 mL，摇匀待分析。

1.3 液相色谱条件

色谱柱:Nova-Pak C18柱(150 mm ×3.9 mm，5 μm);流速:1 mL/min;紫外检测波长:281 nm;柱温:30℃;流动相:体积比为50∶50的乙腈-水(0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液，用磷酸调PH值为3.0);进样体积为 5 μL。

1.4 加标回收率

精密量取培养液50 mL加入萘乙酸25 mg/L的标准溶液1 mL，精密称取鲜细胞10克加入萘乙酸2.5 mg/L的标准溶液1 mL，按上述方法进行前处理和制备，设置3组平行处理，进行加标回收率实验，结果见表1。

表1 样品中萘乙酸的回收率实验结果(n=3)Table 1 Recovery results of α-Naphthylacetic acid in sample(n=3)

1.5 样品的测定

分别平行处理和制备5组细胞和培养液样品，依上述色谱条件，测定5组样品，用外标标准曲线法计算样品中的萘乙酸含量，结果见表2，对照品和样品的色谱图见图(1)(2)(3)，萘乙酸(1号峰)保留时间2.43 min左右。

表2 样品的测定结果(n=5)Table 2 Determination results of sample(n=5)

图3 细胞色谱图Fig.3 The chromatogram of NAA in cell

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

精密称取萘乙酸对照品适量，用乙醇配制成含萘乙酸为10 mg/L的标准溶液，对萘乙酸标准溶液和上述制备的培养液供试品进行紫外光谱扫描，发现萘乙酸标准溶液在281 nm的波长处有较大紫外吸收峰，而培养液样品在281 nm附近紫外吸收较小，为了减少杂质干扰，以达到较好的色谱分离，同时提高灵敏度，选择检测波长为281 nm。

2.2 前处理方法的建立

采用液液萃取法对样品进行前处理，比较简便快捷。对二氯甲烷和乙酸乙酯二种溶剂分别萃取样品进行比较，实验结果表明，所得回收率基本一致，但二氯甲烷萃取所得的样品在色谱图中杂质干扰较少，因此，实验前处理方法采用二氯甲烷和水进行液液萃取。

2.3 流动相条件的优化

据文献［2］报道，采用流动相体积比为70∶30的甲醇-水(磷酸调PH值3.0)可使萘乙酸达到色谱分离，而本实验试用了多种“甲醇-水”溶剂系统，萘乙酸均未能与样品杂质达到色谱分离。而后，改用溶剂系统，通过多次实验，结果以体积比50∶50的乙腈-水(0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液，用磷酸调PH值3.0)为流动相，萘乙酸峰与干扰组分达到良好的色谱分离，满足了分析要求。

2.4 线性关系的考察

精密称取萘乙酸对照品适量，用乙醇配制成含萘乙酸为500 mg/L的储备液，再精密量取适量用乙醇依次稀释成浓度分别为 0.20、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0 mg/L的标准溶液，在优化实验条件下进行液相色谱测定，萘乙酸的质量在0.001～0.125 μg范围内与色谱峰面积呈良好的线性关系，其回归方程为 Y=(3.092×107)X-21920.943(r=0.9998)，其中Y为色谱峰峰面积，X为萘乙酸的量(μg)。

2.5 精密度、检测限和回收率试验结果

精密量取萘乙酸标准溶液5 μL注入色谱仪，重复测定5次，其峰面积的RSD为0.52%。仪器的最低检出量为(S/n=5)0.001 μg，根据样品处理量计算，培养液的检出限为0.02 mg/L，鲜细胞的检出限为0.2 mg/kg。萘乙酸在鲜细胞和培养液样品中的加标回收率实验表明，在该方法条件下，鲜细胞和培养液样品中分别加入萘乙酸对照品，其平均回收率分别为87%和93%。相对标准偏差RSD分别为3.9%和3.3%。

3 结论

本实验方法经过对样品前处理方法和检测波长的筛选，同时对流动相系统的优化，建立了简便、快速、灵敏、准确测定红豆杉细胞培养物中萘乙酸的高效液相色谱法。本方法可以监测红豆杉细胞培养物中萘乙酸的残留。同时，对于红豆杉细胞培养生产紫杉醇过程中控制生长激素水平也具有重要的意义。

1 Mei XG(梅兴国).Taxol Production by Taxus Cell Culture(红豆杉细胞培养生产紫杉醇).Wuhan:Huazhong University of Science and Technology Publisher，2003.10-13.

2 Kong DY(孔德洋)，Shi LL(石利利)，Shan ZJ(单正军)，et al.Determination of α-Naphthylacetic acid by ASE-GPC Coupled with HPLC.J instrum anal(分析测试学报)，2010，29:382-385.