蛹虫草菌株发酵液和菌丝提取物的抑菌活性初探

韩燕峰 张延威 董旋 黄玉 梁宗琦

摘要：研究蛹虫草（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ）的发酵液和菌丝提取物的抑菌效果，为蛹虫草抑菌活性物质的开发利用提供基础资料。采用滤纸柱、海绵柱和花泥柱３种方法检测其抑菌效果，结果表明蛹虫草发酵液及菌丝提取物对大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）和金黄色葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）均有一定抑制作用，其中菌丝提取物抑菌作用较强；对大肠杆菌的抑制强于对金黄色葡萄球菌的抑制。抑菌效果检测方法以滤纸柱法检测效果较好，花泥柱法次之，海绵柱法较差。

关键词：蛹虫草；抑菌；检测方法；发酵液；菌丝提取物

中图分类号：Ｓ５６７．３５；Ｑ９３９．９６文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）16－3492-04

Studies on Antibacterial Activities of Fermentation Broth and Mycelia Extraction of Cordyceps militaris

ＨＡＮ Ｙａｎ－ｆｅｎｇ１，ＺＨＡＮＧ Ｙａｎ－Ｗｅｉ２，ＤＯＮＧ Ｘｕａｎ１，ＨＵＡＮＧ Ｙｕ1，ＬＩＡＮＧ Ｚｏｎｇ－ｑｉ1

（１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｆｕｎｇｕｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ， Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｇｕｉｙａｎｇ ５５００２５，China；

２． Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｎｏｒｍａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｇｕｉｙａｎｇ ５５００１８，China）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈ ａｎｄ ｍｙｃｅｌｉａ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅ ｄａｙｓ ｗｅｒｅ ｅｘｐｌｏｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅｉｒ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ． For ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｏ ｔｅｓｔ ｔｈｅ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｆｆｅｃｔ， ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒ method ｗａｓ ｔｈｅ ｂｅｓｔ， ｆｏｌｌｏｗｅｄ by ｆｌｏｗｅｒ ｍｕｄ ｃｏｌｕｍｎ， ｔｈｅ ｗｏｒｓｔ ｗａｓ ｓｐｏｎｇｅ ｃｏｌｕｍｎ． Ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍｙｃｅｌｉａ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｎ ｂｏｔｈ ｂａｃｔｅｒｉａ ｗａｓ stronger ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈ； ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｂｏｔｈ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｏｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｗａｓ stronger ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｎ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ； ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ； ｔｅｓｔ ｍｅｔｈｏｄ； ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈ； ｍｙｃｅｌｉａ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ

蛹虫草又名北冬虫夏草，是我国名贵中药材冬虫夏草的代用品，含有多种生物活性物质［１，２］。蛹虫草为虫、菌结合体，其真菌也常被称为蛹虫草（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ）。研究发现，蛹虫草的子实体、菌丝体和发酵液中均有多种活性成分，能抑制部分细菌和真菌，对人体具有一定的保健功效，具有潜在应用前景［３－５］。一些关于蛹虫草的研究认为，蛹虫草的抗菌成分可能是虫草素［６，７］、多糖［８］、多肽［９］、酶类［１０］或酚类［１１］，具有抑菌作用可能是单一成分导致也有可能是多组分协同作用。刘阳等［１２］报道发酵液的抑菌效果是单一活性成分抑菌效果的２倍，表明蛹虫草中多种活性成分共同作用的抑菌效果好于单一活性成分的抑菌效果。但针对某一种微生物而言，其主要抑菌活性物质应该是一类或一种物质。

试验采用３种检测材料对蛹虫草菌丝提取物和发酵液进行抑菌效果检测比较，和常用的抑菌效果检测采用的滤纸片法和牛津杯法有所不同。同时比较不同发酵天数的蛹虫草发酵液和菌丝提取物的抑菌效果，以期为蛹虫草抑菌活性物质的开发利用提供基础资料。

１材料与方法

１．１供试菌株

蛹虫草ＧＺＵＩＦＲ－ＺＨ菌株、大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、金黄色葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）为贵州大学真菌资源研究所微生物实验室保存。

１．２培养基

ＰＤＡ固体培养基：马铃薯２００ ｇ去皮切块，煮沸３０ ｍｉｎ后６层纱布过滤，加入葡萄糖、琼脂各２０ ｇ，水１ ０００ ｍＬ。１２１ ℃灭菌３０ ｍｉｎ。

蛹虫草液体发酵培养基：马铃薯２００ ｇ去皮切块，煮沸３０ ｍｉｎ后６层纱布过滤，加入葡萄糖２０ ｇ，水１ ０００ ｍＬ，分装至２５０ ｍＬ三角瓶中，每瓶装液１００ ｍＬ。１２１ ℃灭菌３０ ｍｉｎ。

牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏３ ｇ，蛋白胨１０ ｇ，ＮａCｌ ５ ｇ，琼脂２０ ｇ，水１ ０００ ｍＬ，ｐＨ ７．０～７．２。１２１ ℃灭菌３０ ｍｉｎ。

细菌培养液：牛肉膏３ ｇ，蛋白胨１０ ｇ，ＮａCｌ ５ ｇ，水１ ０００ ｍＬ，ｐＨ ７．０～７．２。１２１ ℃灭菌３０ ｍｉｎ。

１．３试验方法

１．３．１母液培养与发酵蛹虫草菌种活化后，从ＰＤＡ斜面试管中挑取适当大小的菌块，接种至液体发酵培养基中，１７０ ｒ／ｍｉｎ ２５ ℃摇床培养，待母液孢子数达到１０６个／ｍＬ时用移液枪吸取母液转接至新的液体发酵培养基中，接种量每瓶１ ｍＬ，１７０ ｒ／ｍｉｎ ２５ ℃摇床培养，液体发酵培养周期为１０ ｄ。

１．３．２抑菌材料制作滤纸柱：取４张定性滤纸为一叠，用打孔器打孔得到直径为６ ｍｍ的滤纸片，压平后分装入洁净的培养皿中，１２１ ℃灭菌３０ ｍｉｎ，放入烘箱烘干，使用时５叠滤纸片为一组（即一个滤纸柱由２０张滤纸片组成）。

海绵柱：取规整、质地均匀的海绵块（购自超市），用打孔器打孔得到直径为８ ｍｍ、高７ ｍｍ的海绵柱，分装入洁净的培养皿，１２１ ℃灭菌３０ ｍｉｎ，放入烘箱烘干。

花泥柱：取无损、质地均匀的花泥块（购自花店），用打孔器打孔得到直径为７ ｍｍ、高７ ｍｍ的花泥柱，分装入洁净的培养皿，１２１ ℃灭菌３０ ｍｉｎ，放入烘箱烘干。

１．３．３菌丝提取液制备准确称取０．１５ ｇ烘干后的菌丝，放于１．５ ｍＬ蒸馏水中，于超声波振荡仪中提取３０ ｍｉｎ。

１．３．４细菌菌悬液制备供试菌种活化后，从斜面培养基刮下部分菌体，接种于细菌培养液中，３７ ℃培养１８ ｈ，培养后的菌液用血球计数板计数，以细菌培养液调整细菌浓度至１０６个／ｍＬ，制成细菌菌悬液。

１．３．５琼脂扩散法（Ｋ－Ｂ法）试验

１）取已灭菌的干净培养皿，每个培养皿倒入约２０ ｍＬ的牛肉膏蛋白胨固体培养基，静置待其凝透，取水平无冷凝水的平板使用。用移液枪移取１５０ μＬ细菌菌悬液添加到平板，涂布均匀，静置３０ ｍｉｎ待菌液吸收。

２）用移液枪移取培养１～１０ ｄ的发酵液或菌丝提取液１００ μＬ分别加到已灭菌干燥的滤纸柱、海绵柱及花泥柱上，再将其移入平板中如图１的相应位置，每个平板每种材料设对照１个、供试液１个，共６个，３种材料间隔放置，各材料间距离相等。３个重复。发酵液的空白对照为蛹虫草液体发酵培养基，菌丝提取物的空白对照为蒸馏水。

３）将上述平板移入冰箱中静置，待液体充分浸渍到培养基后３７ ℃培养２４ ｈ，观察记录抑菌圈大小，十字交叉法测量抑菌圈直径，取其平均值。

２结果与分析

２．１蛹虫草发酵液的抑菌效果

含发酵液的滤纸柱、海绵柱和花泥柱对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果见表１、图２。由表１、图２可见，海绵柱法未能检测到抑菌效果，而采用滤纸柱和花泥柱的仅培养７ ｄ的发酵液出现抑菌效果，且对大肠杆菌的抑制作用强于对金黄色葡萄球菌的抑制作用。说明在试验中培养７ ｄ的发酵液抑菌物质含量最高，而其余时间可能是因为抑菌物质含量低未能检测到抑菌效果。

２．２蛹虫草菌丝提取物的抑菌效果

含菌丝提取物的滤纸柱、海绵柱和花泥柱对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果见表２、图３。由表２、图３可见，培养４ ｄ后的菌丝提取物在滤纸柱法和花泥柱法检测中出现抑菌效果，且随培养时间的增加，菌丝提取物的抑菌作用增强。培养９ ｄ的菌丝提取物在海绵柱法检测中表现出抑菌效果，抑菌圈较前两种方法小。同时可看出菌丝提取物对大肠杆菌的抑制作用强于对金黄色葡萄球菌的抑制作用。

在试验条件下３种材料用于抑菌检测的效果为：滤纸柱效果最佳，花泥柱次之，海绵柱最差。

２．３菌丝提取物和发酵液抑菌效果比较

对不同培养时间的蛹虫草发酵液和菌丝提取物的抑菌效果进行比较。结果表明，只有培养７ ｄ的发酵液检测出抑菌效果，而从培养４ ｄ开始菌丝提取物表现出抑菌作用，且抑菌作用随培养时间的增加呈上升趋势。比较表１和表２数据，可见蛹虫草菌丝提取物的抑菌效果强于发酵液的抑菌效果。

３小结与讨论

１）试验中为保证使用的３种材料测定的抑菌效果具有可比性，以滤纸柱所能吸收的最大加液量为限，设计加液量为１００ μＬ，但实际使用中海绵柱及花泥柱可吸收的最大加液量远远大于１００ μＬ，故可能存在花泥柱与海绵柱因加液量不足未能表现出应有的检测效果。在试验操作方面，累加５叠滤纸片需要花费较长时间，容易导致细菌污染，移动及摆放存在一定难度；海绵柱因无法主动吸水，需要挤压才能将液体吸入，操作麻烦，也存在较大被污染的可能性；花泥柱可主动吸收液体，拿取容易，摆放方便，较前两者更为方便。综合考虑吸液量大小与操作简便性，推测使用花泥柱只要方法恰当，就能达到较好的检测效果，具体情况有待下一步试验验证。

２）试验中的发酵液具有抑菌效果，这与武忠伟等［４］的报道一致。陈宏伟等［８］报道虫草多糖具有较强的抑菌活性，对大肠杆菌的抑菌圈直径达１１．３ ｍｍ，本试验采用超声波法提取的菌丝提取物的抑菌活性也较强，培养１０ ｄ其对大肠杆菌的抑菌圈直径达到１２．５0 ｍｍ。由于试验采用的是粗提液，发酵液的抑菌成分和菌丝提取物的抑菌成分的确定还有待进一步研究。

３）从试验结果可见，滤纸柱在检测蛹虫草培养物的抑菌效果中表现较好，花泥柱次之，海绵柱较差；蛹虫草发酵液和菌丝提取物均有抑菌作用，总体上对大肠杆菌的抑制强于对金黄色葡萄球菌的抑制；菌丝提取物的抑菌作用强于发酵液。

参考文献：

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