睾酮多克隆抗体的制备及免疫学检测方法的建立

李超英 姜金庆 李凤云 杨金明 吴世秀 刘明成

摘要：采用优化的碳化二亚胺法制备睾酮（ＴＥＳ）人工抗原，免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体，建立间接竞争ＥＬＩＳＡ标准曲线。标准曲线在ＰＢＳ中的线性检测范围为０．０９６～９２．２00 ｎｇ／ｍＬ，相关系数Ｒ２＝０．９７２ ２，半数抑制浓度（ＩＣ５０）为２．８00 ｎｇ／ｍＬ，最低检测限（ＬＯＤ）为０．０３５ ｎｇ／ｍＬ；抗体与去甲睾酮的交叉反应率为２２．３％，与其他检测化合物的交叉反应很小或忽略不计。羊尿２０倍稀释后进行添加回收试验，其添加值与检测值的相关系数为０．９８５ ２。因此，该免疫学方法可用于动物尿液中睾酮残留水平的定量分析。

关键词：睾酮；人工抗原；多克隆抗体；间接竞争ＥＬＩＳＡ

中图分类号：Ｓ８５９．７９文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）16－3554-03

Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｏｆ Ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ

ＬＩ Ｃｈａｏ－ｙｉｎｇ１，２，ＪＩＡＮＧ Ｊｉｎ－ｑｉｎｇ２，ＬＩ Ｆｅｎｇ－ｙｕｎ２，ＹＡＮＧ Ｊｉｎ－ｍｉｎｇ２，ＷＵ Ｓｈｉ－ｘｉｕ２， ＬＩＵ Ｍｉｎｇ－ｃｈｅｎｇ２

（１． Ｃｅｎｔｒｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ， Ｘｉｎｘｉａｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｘｉｎｘｉａｎｇ ４５３００３， Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ；

２． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｈｅｎａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｘｉｎｘｉａｎｇ ４５３００３， Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ （ｉｃＥＬＩＳＡ） ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ （ＴＥＳ） ｒｅｓｉｄｕｅ ｉｎ ｕｒｉｎｅ． Ｔｈｅ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ ＴＥＳ ｗａｓ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｂｙ ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｍｅｔｈｏｄ （ＥＤＣ） ａｎｄ ｔｈｅｎ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｍｍｕｎｅ Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ ｗｈｉｔｅ ｒａｂｂｉｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｌｉｎｅａｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ ｉｎ ＰＢＳ ｗａｓ ｆｒｏｍ ０．０９６ ｔｏ ９２．２00 ｎｇ／ｍＬ， ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ （Ｒ２） ｗａｓ ０．９７２ ２， ｔｈｅ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＬＯＤ） ａｎｄ ＩＣ５０ ｖａｌｕｅ ｗａｓ ０．０３５ ｎｇ／ｍＬ ａｎｄ ２．８00 ｎｇ／ｍＬ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｎｏｒｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ ｗａｓ ２２．３％ ａｎｄ ｓｌｉｇｈｔ ｏｒ ｎｅｇｌｉｇｉｂｌｅ ｔｏ ｏｔｈｅｒ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ． Ｕｎｄｅｒ ２０－ｆｏｌｄ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｓｈｅｅｐ ｕｒｉｎｅ， ａ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ０．９８５ ２ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｄｄｅｄ ａｎｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ． Ｉｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｉｓ ａｓｓａｙ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ ｉｎｔｏ ａ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ＴＥＳ ｒｅｓｉｄｕｅ ｉｎ ｕｒｉｎｅ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ； ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ａｎｔｉｇｅｎ； ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ； ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ

类固醇激素是生物体内产生的一类调节机体代谢功能的微量物质，又称化学信息素。此类物质有较强的蛋白质同化作用，可以提高蛋白质沉积，降低脂肪含量，从而提高饲料转化效率［１］。睾酮是哺乳动物体内常见的具有雄激素作用的类固醇激素，它可以增加肌肉含量，提高骨骼强度，并在雄性生殖器官的发育中发挥重要作用，因而在临床医学中得到应用。外源性睾酮也被运动员非法使用，以提高比赛成绩；养殖场使用睾酮激素后，可以提高经济效益。然而，长期摄入睾酮类激素会导致消费者内分泌紊乱、性早熟，大大增加致癌、致畸的风险［２］。因此，自１９８６年以来，欧盟委员会就禁止在肉食性动物养殖中以促进生长为目的使用自然或人工合成的激素，以保护消费者可能因食用激素的残留物或其代谢物而引起的发育问题、神经问题、遗传毒性和癌症问题［３］。睾酮传统的理化检测方法包括液相色谱－质谱（ＬＣ－ＭＳ）［１，４］和气相色谱－串联质谱（ＧＣ－ＭＳ／ＭＳ）［５］等方法。这些方法灵敏度高、特异性强，但样品前处理繁琐，不适合大批量的市场监测要求。而免疫学检测方法建立在抗体对抗原的分子识别上，其主要优点是亲合力高、快速、简单、经济实用，能够实现对生物液体的小体积、大批量检测，逐渐成为世界各国有毒有害残留物快速检测的方法之一［６］。

本研究以睾酮标准品为起始反应物，经过一系列化学反应制备人工抗原，通过免疫新西兰大白兔获得兔抗睾酮的血清，建立间接竞争ＥＬＩＳＡ检测方法。该研究可以优化液质联用和气质联用等理化方法的样品前处理过程，同时为免疫检测试剂盒和试纸条的研制提供基础。

１材料与方法

１．１试剂与材料

睾酮（ＴＥＳ）、１９－去甲睾酮、勃地酮、雌二醇、群勃龙、甲睾酮、醋酸氯睾酮等标准品购自德国Ｄｒ公司；碳化二亚胺（ＥＤＣ）、弗氏完全佐剂（ＦＣＡ）、弗氏不完全佐剂（ＦＩＡ）由美国Ｐｉｅｒｃｅ公司生产；Ｎ－羟基琥珀酰亚胺（ＮＨＳ）由日本株式会社生产；琥珀酸酐、牛血清白蛋白（ＢＳＡ，ＭＷ６７ ０００）、鸡卵清蛋白（ＯＶＡ，ＭＷ４５ ０００）、羊抗兔酶标二抗（ＧａＲＩｇＧ－ＨＲＰ）、透析袋等购自华美生物工程公司，其他试剂均为分析纯。

１．２仪器与设备

ＭＵＬＴＩＳＫＡＮ ＭＫ３酶标仪和ＧＳ１５Ｒ高速冷冻离心机（美国Ｔｈｅｒｍｏ公司）；ＤＵ８００核酸蛋白分析仪（美国Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ公司）；ＳＺ－９７自动三重蒸馏水器（上海雅荣生化仪器有限公司）；ＰＨＳ－３ＴＣ精密酸度计（上海天达仪器有限公司）。

１．３人工抗原的合成

参照文献［３］，采用优化的ＥＤＣ两步法合成ＴＥＳ人工抗原（图１）。准确称取ＴＥＳ ８８ ｍｇ溶于６ ｍＬ无水吡啶，然后加入１５０ ｍｇ的琥珀酸酐，５０ ℃避光搅拌反应２４ ｈ。氮吹仪吹干吡啶，获得淡黄色油脂状物，５％ ＮａＨＣＯ３溶解后，用乙醚洗涤２次，然后用Ｈ２ＳＯ４进行酸化。离心后弃上清液，残余物用无水硫酸钠干燥，并用乙醚重结晶捣碎，挥发干溶剂所得淡黄色固体物即为半抗原ＴＥＳ琥珀酸酯。

将３８ ｍｇ ＴＥＳ琥珀酸酯用３ ｍＬ Ｎ，Ｎ－二甲基甲酰胺（ＤＭＦ）溶解后，加入１２ ｍｇ ＮＨＳ 和 ３８ ｍｇ ＥＤＣ，３７ ℃条件下避光反应２４ ｈ。离心后取上清液逐滴加入到５ ｍＬ含６６ ｍｇ ＢＳＡ（或４０ ｍｇ ＯＶＡ）的ＰＢＳ缓冲液中，３７ ℃条件下避光振荡反应６ ｈ。反应完成后先用蒸馏水透析３ ｄ，再用ＰＢＳ透析３ ｄ，紫外扫描透析液无小分子吸收峰时分装于安瓿瓶中，－２０ ℃冻干保存。用ＤＵ８００核酸蛋白分析仪扫描人工抗原，进行紫外扫描图谱鉴定。

１．４多克隆抗体的制备

参照文献［７］和［８］的方法，制备兔抗ＴＥＳ多克隆抗体。首免用等体积ＦＣＡ乳化免疫抗原，剂量为５００ μｇ／只（以载体蛋白含量计算）。以后每隔４周加强免疫１次，改用ＦＩＡ乳化，共强化免疫４次。５免后１０ ｄ心脏采血，室温静置２ ｈ，４℃过夜后离心，收集上清，饱和硫酸铵三步盐析法纯化抗体。多克隆抗体加入叠氮钠（V／V，０．０２％）后分装，－７０ ℃保存备用。

１．５免疫学检测方法的建立

间接ＥＬＩＳＡ和间接竞争ＥＬＩＳＡ操作程序参考文献［９］。方阵滴定法优化检测抗原（ＴＥＳ－ＯＶＡ）浓度和多抗（ＴＥＳ ｐＡｂ）稀释倍数，以Ｂ／Ｂ０值（Ｂ是标准品不同稀释度时Ａ４５０nm值，Ｂ０是不加标准品时Ａ４５０nm值）为纵坐标，以标准品不同稀释度的对数值为横坐标，拟合建立间接竞争ＥＬＩＳＡ标准曲线，进行相关分析。灵敏度用ＩＣ５０值表示，代表标准品与检测抗原偶联时的半数抑制浓度；线性范围表示最大信号值２０％～８０％的抑制率（ＩＣ２０－ＩＣ８０）；最低检测限（ＬＯＤ）以ＩＣ１５值计算［１０］。抗体特异性以交叉反应率（ＣＲ）表示［３］，计算公式是：ＣＲ=■×１００%，ＣＲ越低，抗体特异性越强。

１．６添加回收试验

将２０ ｍＬ羊尿充分摇匀，３ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ后取上清液，然后用ＰＢＳ稀释１０倍后直接检测。用甲醇配制ＴＥＳ标准品母液，再用ＰＢＳ稀释成不同的加标浓度检测液，比较添加值和ＥＬＩＳＡ检测值之间的相关关系（相关系数），验证免疫学检测方法的有效性。

２结果与分析

２．１人工抗原紫外特征

在２２０～４００ ｎｍ紫外光区分别对ＴＥＳ、ＢＳＡ和ＴＥＳ－ＢＳＡ进行紫外扫描，结果如图２所示。ＴＥＳ的最大吸收峰在２４８ ｎｍ，ＢＳＡ的最大吸收峰在２７９ ｎｍ，而ＴＥＳ－ＢＳＡ人工抗原的特征吸收峰发生了明显的偏移，其紫外光谱具有明显的ＴＥＳ和ＢＳＡ叠加的特性，证明偶联成功。

２．２间接竞争ＥＬＩＳＡ标准曲线

依据检测抗原和多克隆抗体用量少的原则，选择Ａ４５０ nm值为１．５～２．０左右时，检测抗原和ＴＥＳ ｐＡｂ的最大稀释倍数为理想工作浓度（数据未显示），因此确定本试验体系ＴＥＳ－ＯＶＡ最佳包被质量浓度为２ μｇ／ｍＬ，抗ＴＥＳ ｐＡｂ的最佳工作的稀释度为１∶１０４。优化的间接竞争ＥＬＩＳＡ标准曲线如图３所示，该曲线的回归方程式为ｙ＝－９．８１７ 0 ｌｎｘ＋４８．２３６ 0（Ｒ２＝０．９７２ ２），ＩＣ５０为２．８ ｎｇ／ｍＬ，表明ＴＥＳ ｐＡｂ具有较高的灵敏度。根据公式计算出标准曲线在ＰＢＳ中的线性检测范围为０．０９６～９２．２00 ｎｇ／ｍＬ，最低检测限为０．０３５ ｎｇ／ｍＬ。

２．３抗体特异性

特异性是免疫测定方法中的固有现象，通过测定各种物质的ＩＣ５０值，然后计算其交叉反应率（ＣＲ）。因此，在间接竞争ＥＬＩＳＡ检测过程中，用蛋白同化激素结构类似物代替ＴＥＳ标准品溶液，测定不同竞争物的ＩＣ５０值，计算交叉反应率，结果见表１。从结果来看，去甲睾酮（２２．３％）与ＴＥＳ有较大的交叉反应，这说明ＴＥＳ甾环结构上Ａ和Ｂ环对其性质影响较大。而其他竞争物的交叉反应率很小或没有，说明其竞争物的三维结构差异较大。结果表明，该免疫学方法可用于ＴＥＳ残留水平的检测。

２．４添加回收试验

将羊尿稀释２０倍后添加不同浓度的ＴＥＳ标准品溶液，比较添加浓度和检测值之间的相关系数，其结果见图４。由图4可知，数据点分布于趋势线的两侧，检测回归方程式为ｙ＝０．９１８ ６ ｘ＋１．４５６ ９（Ｒ２＝０．９８５ ２）。这表明本研究建立的ＥＬＩＳＡ检测值具有较高的符合性，可用于动物源样品中ＴＥＳ含量分析的大量筛选。

３结论

人工抗原能否刺激动物产生针对半抗原的特异性抗体，是判断人工抗原合成成败的关键。本试验利用合成的免疫原（ＴＥＳ－ＢＳＡ）对新西兰大白兔进行免疫，并对抗体进行了初步评价。结果表明，合成的人工抗原能有效刺激机体产生特异性免疫应答，获得了较高效价的多克隆抗体，抗体的特异性好、亲和力强，可满足动物性食品中ＴＥＳ的安全评价需要。抗ＴＥＳ多克隆抗体的制备为建立体液中ＴＥＳ残留检测的ＥＬＩＳＡ方法及开发ＴＥＳ快速检测试剂盒奠定了基础。

参考文献：

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［５］ ＨＡＲＴＭＡＮＮ Ｓ， ＳＴＥＩＮＨＡＲＴ Ｈ． Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎａｂｏｌｉｃ ａｎｄ ｃａｔａｂｏｌｉｃ ｓｔｅｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅｓ ｉｎ ｍｅａｔ ｂｙ ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ，１９９７，７０４（１－２）：１０５－１１７．

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［９］ ＪＩＡＮＧ Ｊ Ｑ， ＺＨＡＮＧ Ｈ Ｔ， ＬＩ Ｇ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ－ｎｏｒｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅ－lｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｎｏｒｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｕｒｉｎｅｓ［Ｊ］． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２０１１，４４（１４）：２３７３－２３９３．

［１０］ ＪＩＡＮＧ Ｊ Ｑ， ＺＨＡＮＧ Ｈ Ｔ， ＷＡＮＧ Ｚ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｂａｓｅｄ ＥＬＩＳＡ ａｎｄ ｃｏｌｌｏｉｄａｌ ｇｏｌｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ １９－ｎｏｒｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ ｒｅｓｉｄｕｅ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１１，５９（１８）：９７６３－９７６９．