榨菜下胚轴离体培养植株再生体系的建立

张艳梅 于锡宏 蒋欣梅 卢志权 丛超

摘要：以榨菜（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ Ｃｚｅｒｎ． ｅｔ Ｃｏｓｓ． ｖａｒ． ｔｕｍｉｄａ）Ｂ２－１０１４的下胚轴为外植体，研究了不同浓度的激素以及不同激素组合对愈伤组织、不定芽和不定根诱导的影响。结果表明，榨菜茎段离体培养的植株高频再生体系中愈伤组织诱导培养基为ＭＳ＋０．５ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．８ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ，不定芽诱导培养基为ＭＳ＋２．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．２ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ，不定根诱导培养基为ＭＳ＋０．２ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ，在此培养条件下，Ｂ２－１０１４愈伤组织的诱导率达９０．０％，不定芽诱导率达９２．２％，不定根诱导率达９７．８％。

关键词：榨菜（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ Ｃｚｅｒｎ． ｅｔ Ｃｏｓｓ． ｖａｒ． ｔｕｍｉｄａ）；下胚轴；组织培养；再生植株

中图分类号：Ｑ９４９．７４８．３；Ｑ９４３．１文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）16－3628-04

Establishment of the Regeneration System for in vitro Hypocotyl Culture of

Brassica juncea var. tumida

ＺＨＡＮＧ Ｙａｎ－ｍｅｉ，ＹＵ Ｘｉ－ｈｏｎｇ，ＪＩＡＮＧ Ｘｉｎ－ｍｅｉ，ＬＵ Ｚｈｉ－ｑｕａｎ，ＣＯＮＧ Ｃｈａｏ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ， Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈａｒｂｉｎ １５００３０， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ ｏｆ ｐｉｃｋｌｅ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ Ｃｚｅｒｎ．ｅｔ Ｃｏｓｓ． ｖａｒ． ｔｕｍｉｄａ） ｍａｔｅｒｉａｌ Ｂ２－１０１４ ａｓ ｅｘｐｌａｎｔ， ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｈｏｒｍｏｎｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｏｒｍｏｎｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｎ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｌｌｕｓ， ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｂｕｄ ａｎｄ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｒｏｏｔ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｏｐｔｉｍｕｍ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｃａｌｌｕｓ， ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｂｕｄ ａｎｄ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｒｏｏｔ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｗａｓ ＭＳ＋０．５ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．８ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ， ＭＳ＋２．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．２ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ， ａｎｄ ＭＳ＋０．２ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ； ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｃａｌｌｕｓ， ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｂｕｄ ａｎｄ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｒｏｏｔ of Ｂ２－１０１４ ｃｏｕｌｄ ｒｅａｃｈ up ｔｏ ９０．０％， ９２．２％， ａｎｄ ９７．８％ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｐｉｃｋｌｅ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ Ｃｚｅｒｎ． ｅｔ Ｃｏｓｓ． ｖａｒ． ｔｕｍｉｄａ）； ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ； ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ； ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｐｌａｎｔ

榨菜（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ Ｃｚｅｒｎ． ｅｔ Ｃｏｓｓ． ｖａｒ． ｔｕｍｉｄａ）属十字花科芸薹属芥菜种中以肉质茎为产品的一个变种，属于茎用芥菜。榨菜是中国特产蔬菜，在国际市场上与欧洲酸菜、日本酱菜齐名，被誉为世界三大名腌菜之一，在中国蔬菜加工生产中占有重要的地位，对提高农民收入、发展乡镇企业、提供就业机会以及出口创汇等有着重要意义。

关于离体培养，在芸薹属作物大白菜和青花菜等植株的再生体系方面有很多的相关报道［１－３］，对于榨菜离体培养，已通过带柄子叶、下胚轴培养获得了再生植株［４，５］，陈石头等［４］报道的再生频率高达９０％以上，其他研究的再生频率较低，一般为５０％～６０％［６］。采用不同株系的榨菜、不同的激素［7］、不同培养基，榨菜离体培养的植株再生体系就有可能不同，试验通过对榨菜的下胚轴进行离体培养，研究榨菜的不同株系、不同苗龄以及不同激素组合对再生体系的影响，旨在寻找榨菜外植体离体培养的适宜条件，为榨菜育种材料的保存和繁殖提供可靠的试验方法，也为榨菜多倍体育种打下良好的基础。

１材料与方法

１．１材料

榨菜Ｂ２－１０１４、Ｂ２－１０２０、ＢＺ⊕－１００５、ＢＺ⊕－１００３由东北农业大学蔬菜生理与设施园艺研究室提供，激素６－ＢＡ、２，４－Ｄ、ＮＡＡ由郑州绿博生物科技有限公司提供。

１．２方法

１．２．１无菌苗的获得参照陈竹君等［8］的方法，将精选后的榨菜种子先用体积分数为７０％的乙醇振荡灭菌９０ ｓ，接下来加入１００ ｇ／Ｌ次氯酸钠溶液振荡灭菌１０ ｍｉｎ，然后用无菌水冲洗５次，最后接种于ＭＳ培养基上。于（２５±２） ℃下光照培养，光照度为２ ０００ ｌｘ，光照时间为１６ ｈ／ｄ。

１．２．２榨菜株系种类的筛选选用榨菜Ｂ２－１０１４、Ｂ２－１０２０、ＢＺ⊕－１００５和ＢＺ⊕－１００３这４种株系进行无菌培育，培育４ ｄ后取下胚轴接种于ＭＳ培养基中进行愈伤组织诱导。每种培养基中均添加３０ ｇ／Ｌ蔗糖、８ ｇ／Ｌ琼脂、２．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ和０．４ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ［４］，接种１４ ｄ后统计愈伤组织的诱导率。每个处理的外植体为３０个，３次重复。

１．２．３榨菜苗龄大小的筛选将不同苗龄（３、４、５、６、７ ｄ）榨菜幼苗的下胚轴切成０．５ ｃｍ小段，接种于ＭＳ培养基中进行愈伤组织诱导。每种培养基中均添加３０ ｇ／Ｌ蔗糖、８ ｇ／Ｌ琼脂、２．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ和０．４ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ。接种１４ ｄ后统计愈伤组织的诱导率。每个处理的外植体为３０个，３次重复。

１．２．４基本培养基的筛选以Ｂ２－１０１４为试材，将培养５ ｄ的榨菜无菌苗下胚轴切成０．５ ｃｍ小段，接种于基本培养基ＭＳ、１／２ＭＳ、１／４ＭＳ和１／８ＭＳ中进行愈伤组织诱导。每种基本培养基中均添加３０ ｇ／Ｌ蔗糖、８ ｇ／Ｌ琼脂、２．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ和０．４ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ。接种１４ ｄ后统计愈伤组织的诱导率。每个处理的外植体为３０个，３次重复。

１．２．５不同激素组合对愈伤组织诱导的影响将培养５ ｄ的Ｂ２－１０１４无菌苗下胚轴切成０．５ ｃｍ小段，接种于含不同浓度的６－ＢＡ和２，４－Ｄ、６－ＢＡ和ＮＡＡ组合的培养基ＭＳ中诱导愈伤组织形成，不含有激素的为对照，激素组合见表１、表２。接种１４ ｄ后统计愈伤组织的诱导率。每个处理的外植体为３０个，３次重复。

１．２．６不定芽的诱导利用筛选出的基本培养基，将继代培养后的愈伤组织转移至含不同浓度６－ＢＡ和ＮＡＡ（表３）的培养基中诱导不定芽形成。１６ ｄ后调查不定芽的诱导率。不含有激素的处理作对照。每个处理的外植体为３０个，３次重复。

１．２．７不定根的诱导与移栽利用筛选出的基本培养基，从不定芽上切取２～３ ｃｍ的再生芽，接种于含不同浓度（０、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７ ｍｇ／Ｌ）ＮＡＡ的培养基中进行培养，培养２～３周后统计不定根的诱导率，每个处理的外植体为３０个，３次重复。

将生根后的小苗去掉封口膜，放在实验室中炼苗３ ｄ，将苗取出，并用自来水洗去小植株根部附着的培养基，将小植株移栽于营养钵中保湿１周左右，计算成活率。

２结果与分析

２．１榨菜株系种类的筛选结果

不同榨菜株系愈伤组织的诱导率是不同的，由表４可知，Ｂ２－１０１４愈伤组织诱导的效果最好，诱导率高达９０．０％，而其他３种株系Ｂ２－１０２０、ＢＺ⊕－１００５、ＢＺ⊕－１００３愈伤组织的诱导率很低，均不超过５０％，不同株系之间诱导率差异显著。因此，最佳榨菜株系为Ｂ２－１０１４。

２．２榨菜苗龄大小的筛选结果

由表５可知，不同苗龄榨菜愈伤组织的诱导效果有显著的差异，３ ｄ苗龄榨菜幼苗的愈伤组织诱导率最低，４ ｄ苗龄榨菜的愈伤组织诱导率最高，为９０．０％，之后随着榨菜苗龄的增加，诱导率逐渐下降。植物在个体发育时会经历幼态期、成熟期和衰老期，一般情况下，幼态组织比老态组织具有较强的形态发生能力［9］。因此，榨菜的最佳苗龄为４ ｄ。

２．３基本培养基的筛选结果

由表６可知，基本培养基ＭＳ的愈伤组织诱导率最高，达到了４７．８％，显著高于其他基本培养基（１／２ＭＳ、１／４ＭＳ、１／８ＭＳ），基本培养基１／２ＭＳ、１／４ＭＳ、１／８ＭＳ的愈伤组织诱导率差异不显著。

２．４不同激素组合对愈伤组织诱导的影响

不同激素组合（６－ＢＡ和２，４－Ｄ、６－ＢＡ和ＮＡＡ）对愈伤组织诱导产生了一定的影响（表７，图１Ａ），其中处理Ｈ９（０．５ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．８ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ）的愈伤组织诱导率最高，达到了９０．０％，显著高于其他处理。同时，在含有２，４－Ｄ的培养基中愈伤组织的诱导效果明显不如含ＮＡＡ的诱导效果好。

２．５不同浓度激素组合对不定芽诱导的影响

１６ ｄ后在多数培养基上均能分化出不定芽（表８，图１Ｂ），其中处理Ｋ２７（２．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．２ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ）的培养效果最好，不定芽诱导率最高，达到了９２．２％，显著高于其他处理。试验结果表明，较高浓度的６－ＢＡ结合较低浓度的ＮＡＡ有利于不定芽的分化。

２．６不同浓度ＮＡＡ对不定根诱导的影响

在８种培养基上均形成不定根（表９，图１C），当ＮＡＡ浓度达到０．２ ｍｇ／Ｌ时，不定根的诱导率达到最大，即培养基ＭＳ＋ＮＡＡ ０．２ ｍｇ／Ｌ的生根效果最好，其根系粗壮，根毛较多，不定根诱导率高达９７．８％，显著高于其他处理；随后不定根诱导率随着ＮＡＡ浓度的继续增大而降低。当ＮＡＡ浓度低于０．２ ｍｇ／Ｌ时只产生少数不定根或不发根，根毛也少；过高浓度ＮＡＡ会使芽的基部产生大量愈伤组织，抑制不定根的形成。

将在实验室驯化后的再生植株移栽到沙质混合基质中，盖上塑料薄膜在温室保湿培养１周，然后移栽到土壤中，进行正常的田间管理，发现成活率可达９９％以上，且植株生长良好（图１D）。

３小结与讨论

建立高频再生体系是进行植物遗传转化的前提。芥菜类的愈伤组织难以分化主要受基因型、外植体种类、培养基成分、激素种类和浓度的限制［１0］。利用下胚轴同样能获得很高的再生频率，在利用榨菜下胚轴组织培养时再生频率达到了９０％以上［３，１1］。可见，不同的外植体分化所需的条件不同，若给予适当的条件，外植体均可能分化出芽。

对不同蔬菜用不同外植体进行芽增殖或愈伤组织诱导时，培养基中添加的激素浓度和种类不尽相同［１2］，Ｔａｋａｓａｋｉ等［１3］也曾报道在白菜子叶培养中6-ＢＡ和ＮＡＡ是必不可少的激素。而甘蓝型油菜的子叶培养，只有6-ＢＡ是必需的激素。在此次试验中，榨菜外植体的分化需要6-ＢＡ和ＮＡＡ。不同种类的生长素的作用有明显差异，ＮＡＡ的效果显著优于２，４－Ｄ。在含有２，４－Ｄ的培养基上，外植体分化比较慢，诱导效果差。

总之，利用下胚轴作为外植体进行离体培养的最佳植株再生体系为愈伤组织诱导培养基ＭＳ＋０．５ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．８ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ，不定芽诱导培养基ＭＳ＋２．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．２ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ，不定根诱导培养基ＭＳ＋０．２ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ，在此培养条件下，Ｂ２－１０１４愈伤组织的诱导率达９０．０％，不定芽诱导率达９２．２％，不定根诱导率达９７．８％。下胚轴离体培养的研究为下一步榨菜株系多倍体诱导打下了基础。

参考文献：

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［３］ 李艳红，宋秀珍，庄木．青花菜组织培养再生体系的研究［Ｊ］．首都师范大学学报（自然科学版），２００１，２２（３）：４８－５３．

［４］ 陈石头，余小林，曹家树，等．榨菜子叶和带柄子叶再生植株的研究［Ｊ］．浙江农业学报，２００５，１７（１）：２７－３０．

［５］ 徐春霞，葛亚明，朱雪云，等． 榨菜继代培养愈伤组织及其再生植株的变异性分析［Ｊ］．核农学报，２００７，２１（３）：２３７－２４１．

［６］ 雷建军，陈世儒，郭余龙，等．茎用芥菜叶片原生质体培养及植株再生［Ｊ］．植物学报，１９９１，３３（２）：９１－９７．

［7］ 林友豪，周谟兵，孙玉，等．基本培养基、激素在西瓜组织培养中对不定芽发生的影响［Ｊ］．湖北农业科学，２００３（６）：７１－７２．

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［１1］ 陈石头．榨菜高效再生体系的建立及其遗传转化影响因子的研究［Ｄ］．杭州：浙江大学，２００４．

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［１3］ ＴＡＫＡＳＡＫＩ Ｔ，ＨＡＴＡＫＥＹＡＭＡ Ｋ，ＯＪＩＭＡ Ｋ，ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ｆａｃｔｏｒｓ （ｈｏｒｍｏｎｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ，ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ａｎｄ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ） ｏｎ ｓｈｏｏｔ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ ｅｘｐｌａｎｔｓ ｉｎ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ Ｌ．［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｅｔｔｅｒ，１９９６，１３（２）：１７７－１８０．