贵州省幽门螺杆菌临床菌株的抗生素耐药现状

刘 苓，胡 林，刘娅琳，周 力，车筑萍，谭庆华

贵州省贵阳医学院附属医院1.消化内科;2.内镜中心，贵州贵阳 550004

贵州省幽门螺杆菌临床菌株的抗生素耐药现状

刘 苓1，胡 林1，刘娅琳1，周 力1，车筑萍2，谭庆华2

贵州省贵阳医学院附属医院1.消化内科;2.内镜中心，贵州贵阳 550004

目的 检测贵州省幽门螺杆菌 (Helicobacter pylori，H.pylori)临床菌株对多种抗生素的耐药率，并分析甲硝唑(MTZ)、克拉霉素(CLA)、阿莫西林(AMO)耐药菌株的临床特征。方法 以贵州地区30株培养成功的H.pylori临床菌株为研究对象，采用Kirby-Bauer及E-test法测定菌株对MTZ、CLA、AMO等多种抗生素的耐药性。分析MTZ、CLA、AMO耐药菌株与敏感菌株患者性别、年龄及疾病种类的差异。结果 Kirby-Bauer法显示H.pylori临床菌株对AMO、左氧氟沙星、庆大霉素、CLA、四环素、头孢呋肟、复方新诺明的耐药率分别为 20.00%、3.33%、13.33%、30.00%、6.67%、0、0;E-test法显示 H.pylori临床菌株对 MTZ、AMO、CLA 耐药率分别为63.33%、26.67%、33.33%;两种检查方法检测结果无明显差异;男性患者 MTZ的耐药率(77.78%)较女性患者(41.67%)高(P＜0.05);30～60岁年龄组患者MTZ的耐药率更高(P＜0.05);CLA和AMO的耐药率与疾病种类、性别、年龄无明显关系(P＞0.05)。结论 贵州地区H.pylori临床菌株的耐药现状不容忽视，以男性消化性溃疡患者年龄在30～60岁对MTZ的耐药率较高。

幽门螺杆菌;抗生素耐药

根除幽门螺杆菌 (Helicobacter pylori，H.pylori)是临床治疗H.pylori相关性上消化道疾患的重要策略，根除H.pylori不仅能加速消化性溃疡的愈合，而且能显著降低溃疡复发率，也可预防胃黏膜癌前变化如萎缩性胃炎、肠化生、胃癌的发生，故对上消化道疾病的防治具有重要的意义。目前，三联疗法是推荐的一线根除H.pylori治疗方案，常用的抗生素有甲硝唑(Metronidazole，MTZ)、克拉霉素(Carithromycin，CLA)和阿莫西林(Amoxicillin，AMO)，其他的二线抗生素如四环素、左氧氟沙星、庆大霉素等也常用于胃肠病的防治。

随着抗生素在临床治疗中的广泛应用，H.pylori的耐药率逐年上升，根除H.pylori的难度逐年增加。目前，CLA的高耐药率主要出现在欧美及亚洲发达地区［1］;MTZ 的高耐药率(≥80)主要出现在非洲［2］，但很多地区高耐药的MTZ在瑞典［3］能得到很好的治疗效果;AMO的耐药率在欧洲低于2%，在亚非拉国家为6% ～59%［4］。我国2005年所做的流行病学调查［5］显示H.pylori对MTZ的耐药率已超过70%，部分地区甚至达100%;对CLA的耐药率也达到25%。故H.pylori对抗生素的耐药存在显著的地区差异。我省迄今尚缺乏H.pylori耐药状况的调查资料。本研究检测了贵州地区 H.pylori临床菌株对 MTZ、AMO、CLA等多种抗生素的药敏情况并分析耐药患者的临床特点，有助于了解贵州地区H.pylori对抗生素的耐药现状，指导贵州地区抗H.pylori的临床治疗，为贵州地区H.pylori临床基础综合研究奠定基础。

1 资料与方法

1.1 研究对象 30例临床分离菌株来自2007年-2009年因上消化系症状就诊于我院行胃镜检查的98例患者，男18例，女12例，年龄20～77岁，中位年龄48.77 岁。

1.2 仪器与设备 微需氧培养罐 (Mitsubishi，Japan);恒温培养箱;微需氧产气袋 (850 mL/L N2，100 mL/L CO2，50 mL/L O2)(Mitsubishi，Japan);尿素酶试纸(天和微生物试剂有限公司，杭州);AMO、CLA、MTZ E-test药敏试纸(AB BIODISK，瑞典);Kirby-Bauer药敏纸片，包括:CLA、AMO、左氧氟沙星、庆大霉素、四环素、头孢呋肟、复方新诺明(天和微生物试剂有限公司，杭州)。

1.3 方法

1.3.1 标本采集、生化鉴定、标本转运、接种、培养、阳性鉴定:参见胡林等［6］的《贵州省幽门螺杆菌临床菌株的分离培养》。

1.3.2 Kirby-Bauer纸片扩散法及 E-test药敏试验:Kirby-Bauer纸片扩散法:抗生素敏感性的判定参照中国药品生物制品鉴定所制定的抗菌药药敏试验判定标准，抑菌环直径＜7 mm判定为耐药。E-test药敏试验:记录MIC，耐药测定范围为0.016～256 mg/L。

1.3.3 抗生素耐药率的检测及耐药患者临床特征的采集:以E-test检测的MTZ、CLA、AMO敏感患者为对照，分别分析上述三种抗生素耐药患者近期用药史、上消化道疾患病种、性别、年龄等方面的特征。

1.4 统计学处理 数据使用SPSS 16.0统计软件进行χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Kirby-Bauer 纸片扩散法检测 CLA、AMO、左氧氟沙星、庆大霉素和四环素的耐药率分别为30.00%、20.00%、3.33%、13.33%、6.67%，头孢呋肟和复方新诺明未见耐药菌株。CLA的耐药率较左氧氟沙星和四环素的耐药率高(P＜0.05)，AMO的耐药率较左氧氟沙星的耐药率高(P＜0.05)，其他抗生素之间的耐药率比较无显著性差异(见图1)。

图1 Kirby-Bauer纸片扩散法检测贵州地区H.pylori对不同抗生素的耐药现状Fig 1 Resistant rates of H.pylori to different antibiotics by Kirby-Bauer disk diffusion test in Guizhou province

2.2 E-test试验检测 MTZ、CLA、AMO的耐药率分别为 63.33%、33.33%、26.67%。MTZ 的耐药率比AMO和CLA的耐药率明显较高(63.33%vs 33.33%、26.67%，P＜0.05)，AMO 和 CLA 的耐药率无明显差异(33.33%vs 26.67%，P ＞0.05，见表1)。

Kirby-Bauer纸片扩散法与E-test试验结果对比，CLA的耐药率分别为 30.00%(9/30)和 33.33%(10/30)，AMO的耐药率分别为 20.00%(6/30)和26.67%(8/30)，两种方法检测的耐药率均无显著性差异(P值分别为0.781和0.542)。

2.3 耐药患者的上消化道疾患特征 消化性溃疡患者MTZ耐药率较慢性胃炎伴糜烂患者的耐药率高(84.62%vs 27.27%，P ＜0.05)。十二指肠炎、慢性胃炎伴糜烂、消化性溃疡患者对CLA和AMO的耐药率无明显差异 (见表2)。

2.4 耐药患者的性别特征 MTZ、AMO、CLA的耐药情况在男性、女性之间进行比较，结果发现男性患者对MTZ的耐药率较女性患者对MTZ的耐药率高(77.7%vs 41.67%，P＜0.05)，两组对CLA和AMO的耐药率无明显差异 (见表3)。

2.5 耐药患者的年龄特征 30～60岁年龄组对MTZ的耐药率比其他年龄组对MTZ的耐药率高(83.33%、20.00%、42.86%，P ＜ 0.05)，各年龄组对 CLA 和AMO的耐药率相比差异无统计学意义(P＞0.05，见表4)。

表2 贵州地区H.pylori对抗生素的耐药情况与患者疾病的关系Tab 2 Relationship of resistant rates of H.pylori to antibiotics with different diseases in Guizhou province

表3 贵州地区H.pylori对抗生素的耐药情况与患者性别的关系Tab 3 Relationship of resistant rates of H.pylori to antibiotics with gender in Guizhou province

表4 贵州地区H.pylori对抗生素的耐药情况与各年龄组的关系Tab 4 Relationship of resistant rates of H.pylori to antibiotics with ages in Guizhou province

3 讨论

研究显示H.pylori对抗生素的耐药率逐年增加，三联疗法的 H.pylori根除率已从20世纪90年代的90%降到目前的70%左右。地区性抗生素耐药及敏感情况的调查，有助于了解当地 H.pylori耐药率的变迁，从而指导地区抗生素的使用。本研究首次从我省上消化道疾病患者胃黏膜中成功分离培养H.pylori临床菌株30例，经药敏法检测我省H.pylori临床菌株对抗生素的耐药现状。

随着对H.pylori检测技术的开展，已经开发出多种对H.pylori耐药的检测方法。不同的药敏实验方法和实验条件会得到不同的药敏实验结果，纸片扩散法(Kirby-Bauer test)和 E 试验法(E-test)［7］是目前公认的体外抗菌药物敏感试验。Kirby-Bauer test简单易行、价格便宜、药物选择灵活，适用于对生长快的细菌进行药敏试验，广泛用于体外药敏实验的研究。但Kirby-Bauer test的结果缺乏定量的判断标准，不能准确检测药物的MIC。E-test操作简单、定量检测、MIC结果直观准确、可直接读取、重复性好，缺点是试纸价格昂贵。为评价两者在研究H.pylori耐药性的价值和临床适用性，比较其结果差异显著性，为临床研究提供依据，本研究针对常用的抗生素CLA、AMO，采用Kirby-Bauer test和E-test两种方法进行了耐药性对比分析。结果显示，Kirby-Bauer test和E-test检测CLA的耐药率分别为30.00%、33.33%，检测AMO的耐药率分别为20.00%、26.67%。两种方法的统计结果比较差异无统计学意义(P＞0.05)，故经济实惠的Kirby-Bauer test检测结果也可以作为临床检测H.pylori耐药的有效方法。

MTZ属于硝基咪唑类衍生物，具有高效、广谱的杀菌作用，其作用不受胃酸影响，价格低廉，因此在发展中国家成为治疗 H.pylori感染的首选药物。H.pylori对MTZ的耐药性是全球性的，在世界范围内，主要体现为发展中国家显著高于发达国家;H.pylori对MTZ的耐药性有逐年升高的趋势，北京地区 H.pylori对MTZ的耐药情况从1999年的36.3%上升到2005年的79.2%［8］。本研究显示贵州地区 MTZ的耐药率目前高达63.33%，与我国其他地区一样处于较高水平。

CLA是新一代大环内酯类药物，在胃内低pH值环境下仍有较好的稳定性和杀菌作用。不同国家不同地区的耐药情况存在差异。近期资料显示，在亚洲及经济较落后地区耐药率低，而在发达地区耐药率均高达20%［1］。本研究显示贵州地区 H.pylori对CLA的耐药率为33.33%，与其他地区相比较，处于较高水平。AMO是临床常用药物，H.pylori对其不易产生耐药性，一直以来都作为抗H.pylori的首选药物之一，可能与其耐药性并非由内酰胺酶基因介导有关，但近年来耐药菌株也逐渐增多［9］。本研究显示贵州地区H.pylori对AMO的耐药率为26.67%，应当引起临床工作者的重视。

由于一线抗生素耐药情况的恶化，临床上针对耐药患者可推荐使用左氧氟沙星、四环素、庆大霉素等二线治疗，但随着这些药物在临床上逐渐普及使用，耐药问题也凸显出来。我们的研究显示贵州地区对二线抗生素左氧氟沙星、四环素、庆大霉素的耐药率分别为3.33%、6.67%、13.33%，情况较发达地区乐观。为了进一步拓宽贵州地区抗 H.pylori治疗的选择，我们增加了头孢呋肟和复方新诺明。头孢呋肟与AMO同属于β-内酰胺类药物，可广泛作用于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，对范围广泛的常见病原菌均有杀菌活性，对许多AMO耐药的菌株都有效;后者由于价格低廉，在贵州地区仍然广泛用于感染的治疗。本研究显示头孢呋肟、复方新诺明对 H.pylori菌株的耐药率均为0、0。

为了临床治疗的有效性，我们进一步分析了抗生素耐药菌株与临床疾病的相关性。消化性溃疡患者对MTZ的耐药率较慢性胃炎伴糜烂患者的耐药率更高(84.62%vs 27.27%，P ＜0.05)，可能与消化性溃疡患者临床症状较慢性胃炎重，服用药物种类多、量多、时间长从而导致产生继发性耐药有关;既往报道H.pylori对MTZ的耐药率女性高于男性［10］，认为可能与该药较广泛用于妇科疾病和口腔科疾病治疗、致细菌的硝基还原酶rdxA及frxa基因突变有关，我们的研究显示贵州地区男性患者对MTZ的耐药率较女性患者高;耐药患者的性别研究显示30～60岁年龄组对MTZ的耐药率与20～30岁组和60～80岁组相比显著较高(P＜0.05)，研究结果和国内外报道基本一致。遗憾的是，对CLA和AMO耐药患者，不论疾病种类，还是性别、年龄与敏感组相比较，均未发现特征性变化。

综上所述，针对贵州地区的H.pylori耐药现状，我们提出以下建议:(1)本研究提示贵州地区MTZ的耐药率高达63.33%，故我们推荐不要把MTZ作为首选的抗H.pylori治疗药物，尤其是男性消化性溃疡患者应避免选用MTZ;(2)CLA可作为首选的抗 H.pylori治疗药物，但需警惕其耐药性的存在，对复治或难治患者，不宜作为首选;(3)AMO、左氧氟沙星、庆大霉素、四环素、头孢呋肟、复方新诺明耐药率均较低，均可作为贵州地区抗H.pylori治疗的较好选择，但需警惕其超敏反应和毒副作用;(4)针对日益严重的抗生素耐药情况，部分患者必要时可通过经济实惠的纸片扩散法选择敏感性强的抗生素治疗;(5)临床工作者需高度重视愈演愈烈的 H.pylori抗生素耐药情况，临床上应严格重视抗 H.pylori的适应证。

总之，本研究在我省首次进行 H.pylori耐药状况的流行病学调查，对本地区常用抗生素耐药率有了初步了解。我们还需要对本地区H.pylori对抗生素的耐药性进行持续和更广泛的监测。

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Antibiotic resistance of Helicobacter pylori in Guizhou Province

LIU Ling1，HU Lin1，LIU Yalin1，ZHOU Li1，CHE Zhuping2，TAN Qinghua2
1.Department of Gastroenterology;2.Department of Endoscopy，Affiliated Hospital of Guiyang Medical College，Guiyang 550004，China

ObjectiveTo determine the Helicobacter pylori(H.pylori)resistance to multiple antibiotics and the clinical features of antibiotic-resistance patients.Methods30 H.pylori strains were successfully isolated.Resistance to different antibiotics，including clarithromycin(CLA)，amoxicillin(AMO)and metronidazole(MTZ)were determined by Kirby-Bauer and E-testMethods.Information of clinical features was gathered.ResultsKirby-BauerResultsshowed 20.00%，3.33%，13.33%，30.00%，6.67%，0，0 of the strains were resistant to AMO，levofloxcin，gentamicin，CLA，tetracycline，cefuroxime or SMZ-TMP respectively.E-testResultsmanifested that 63.33%，26.67%，33.33%of the strains were resistant to MTZ，AMO or CLA respectively.The resistance rate of H.pylori to MTZ in male patients(77.78%)was higher than that in female patients(41.67%)(P ＜0.05).The resistance rate of H.pylori to MTZ in patients with peptic ulcer(84.62%)was higher than that in patients with erosive gastritis(27.27%)(P ＜0.05).Patients aged 30～60 years old had a higher resistance rate to MTZ than other groups(P ＞0.05).There was no significant difference in CLA and AMO resistance rate among sex ages or disease.ConclusionResistance of H.pylori to antibodies should be pay more concern in Guizhou province.Resistant rate of H.pylori to MTZ is the highest compared with other antibodies，especially in male patients with peptic ulcer around 30 ～60 ages.

Helicobacter pylori;Antibiotic resistance

R57

A

1006-5709(2012)08-0702-04

2012-02-07

10.3969/j.issn.1006-5709.2012.08.005

贵州省优秀科技教育人才省长专项资金项目，黔省专合字(2008)94号

刘苓，医学博士，主要从事幽门螺杆菌及肠黏膜免疫研究。E-mail:lingzipurple@163.com