改良的FOLIN-CIOCALTEU比色法测定核桃外果皮中总多黔含量

徐 佳，辛立方，张瑞廷，王华斌，傅 力

(1.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐 830052;

2.韩山师范学院生物系，广东潮州 521041)

改良的FOLIN-CIOCALTEU比色法测定核桃外果皮中总多黔含量

徐 佳1，辛立方1，张瑞廷1，王华斌1，傅 力2，*

(1.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐 830052;

2.韩山师范学院生物系，广东潮州 521041)

目的:建立核桃外果皮中总多酚含量的比色测定方法。方法:以没食子酸为对照品，对测定核桃外果皮中总多酚含量的比色条件，包括检测波长、碳酸钠溶液用量、Folin－Ciocalteu试剂用量、反应温度及时间对吸光值的影响进行了研究。结果:对照品标准曲线在1～7μg/mL范围内为y=0.1031x+0.0793，R2=0.9996，线性关系良好，测定方法为采用核桃外果皮中总多酚提取液1.0mL，Folin－Ciocalteu试剂1.0mL、15%的碳酸钠溶液4.0mL、30℃显色1.5h，平均回收率为100.2%(RSD=0.91%)。此条件下测得核桃外果皮中总多酚含量为3.306mg/g。结论:该方法简便快速、结果准确、重现性和稳定性好，可用于核桃外果皮中总多酚含量的测定。

核桃外果皮，总多酚，含量测定，比色条件

核桃外果皮又称青龙衣，核桃外果皮中含有胡桃醌、α－氢化胡桃醌－4－葡萄糖苷、VC、鞣质、没食子酸、胡桃醌生物碱和萘醌等［1］。近年来大量的研究表明，多酚类化合物具有抗肿瘤、抗病毒、抑菌、抗氧化等作用而被广泛利用。测定多酚含量的比色法有高锰酸钾法［2］，酒石酸亚铁法［3］，普鲁士兰法［4］等，但是高锰酸钾法具有误差大、操作繁琐等缺点，酒石酸亚铁法对测定儿茶素类物质具有专属性，普鲁士兰法在测定多酚时具有数据不稳定、误差大等缺点［5］，而Folin－Ciocalteu比色法是植物多酚类化合物常用的测定方法，具有成本低廉、操作简便易行、准确度和精密度高等优点。目前关于石榴皮［6］、猕猴桃［7］、桑葚［8］等多酚测定条件的研究较多，而关于研究核桃外果皮总多酚含量测定条件的文献很少，通过查阅相关文献，发现比色法测定核桃外果皮多酚的方法目前只有万政敏［9］用普鲁士蓝法对核桃外果皮进行测定，未见有其他比色法的报道。由于植物多酚是一类混合物，所以不同来源的植物多酚在比色法测定上条件也有所不同［10－12］，需对其测定方法进行完善。本实验以核桃外果皮为原料，对碳酸钠、Folin－Ciocalteu试剂用量及显色温度，显色时间进行优化，建立核桃外果皮中总多酚含量测定方法，为核桃外果皮的综合开发利用研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

核桃外果皮 2010年9月收于新疆阿克苏乌什县，阴干粉碎，过60目筛，将其放入棕色广口瓶中保存备用;没食子酸对照品 天津市光复精细化工研究所;Folin－Ciocalteu试剂 Sigma公司;无水碳酸钠，无水乙醇 均为分析纯。

TU－1810紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;电热恒温水浴锅 北京市永光明医疗仪器厂;SHB－3循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司;RE－85C旋转蒸发仪 上海青浦沪西仪器厂;电子天平 梅特勒－托利多仪器有限公司;KQ－100B型超声波清洗机 昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品液及标准液的配制 称取5g核桃外果皮粗粉(60目)，加入80mL 80%乙醇采用超声辅助提取法提取三次，超声功率为100W，每次提取20min，合并三次提取液，过滤，减压浓缩，再用80%乙醇定容至100mL，得到样品液。

精确称取0.025g没食子酸标准品，用蒸馏水溶解并定容至1000mL，得到浓度为0.025mg/mL的标准液。

1.2.2 最佳测量波长的选择［8］分别移取0.5mL标准液和样品液，加入1.0mLFolin－Ciocalteu试剂及3.0mL质量分数为12%的Na2CO3溶液，用蒸馏水定容至25mL，常温静置反应1h后，用紫外可见分光光度计在400～800nm波长范围内扫描，确定最佳检测波长。

1.2.3 比色体系各试剂用量的确定

1.2.3.1 Na2CO3溶液质量浓度的确定 取5份0.5mL标准液，加入1.0mLFolin－Ciocalteu试剂，在8min内加入4.0mL质量浓度为10%、12.5%、15%、17.5%、20%的Na2CO3溶液，蒸馏水定容至25mL，常温反应1h，在最佳检测波长处测量其吸光度，确定Na2CO3溶液的最佳质量浓度。

1.2.3.2 Na2CO3溶液用量的确定 选择最佳质量浓度的Na2CO3溶液，用量分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，按照1.2.3.1方法，确定Na2CO3溶液的最佳用量。

1.2.3.3Folin－Ciocalteu试剂用量的确定 取6份0.5mL标准液，分别加入0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mLFolin－Ciocalteu试剂，按照1.2.3.1方法，确定Folin－Ciocalteu试剂的最佳用量。

1.2.3.4 反应温度的确定 选择反应温度为20、30、40、50、60℃，按照1.2.3.1方法，确定最佳反应温度。

1.2.3.5 显色时间的确定 选择显色时间为0.5、1.0、1.5、2.0、3.0h，按照1.2.3.1方法，确定最佳显色时间。

1.2.4 标准曲线的建立 准确吸取没食子酸标准液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0mL，按照1.2.3中确定的最佳条件实验，绘制标准曲线。

1.2.5 比色方法评价

1.2.5.1 精密度实验 取1份1.0mL没食子酸标准液，按照1.2.3中确定的最佳条件实验，重复测定5次，计算结果的相对标准偏差，评价该方法的精密度。

1.2.5.2 稳定性实验 取7份1.0mL样品液，按照1.2.3中确定的最佳条件实验，避光放置0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0h，计算结果的相对标准偏差，评价该方法的稳定性。

1.2.5.3 重复性实验 取5份1.0mL样品液，按照

1.2.3中确定的最佳条件实验，计算结果的相对标准偏差，评价该方法的重复性。

1.2.5.4 加标回收实验 取4份1.0mL样品液，分别加入不同体积的没食子酸标准液，按照1.2.3中确定的最佳条件实验，计算没食子酸的回收率和相对标准偏差。

1.2.5.5 核桃外果皮总多酚含量的测定 取1.0mL样品液按照1.2.3中确定的最佳条件实验，测定样品液的吸光度，通过式(1)计算出样品液中多酚的含量。

式中:M为核桃外果皮样品液中总多酚的含量(mg/g);m为核桃外果皮样品的质量(g);100为样品液定容的体积(mL);25为测量时样品液定容的体积(mL);y为吸光值。

2 结果与讨论

2.1 最佳吸收波长的选择

结果见图1，在波长为697nm处有最大吸收峰，故选择697nm为最佳检测波长。

图1 标准和样品溶液的波长扫描结果Fig.1 Scanning spectra of standard gallic acid solution and sample after reaction with Folin－Ciocalteu reagent

2.2 比色体系各试剂用量的确定

2.2.1 Na2CO3溶液质量浓度的确定 从图2看出，溶液的吸光值随着Na2CO3溶液质量浓度的增加而上升，当Na2CO3质量浓度为15%时，溶液吸光值达到最大，当Na2CO3质量浓度大于15%时，吸光值减小，因此选择Na2CO3的质量浓度为15%。温度对碳酸钠的溶解度影响较大，而且高浓度的碳酸钠较易析出晶体，影响测定分析，文献中多采用低浓度的碳酸钠溶液［13－14］。

2.2.2 Na2CO3溶液用量的确定 从图3得出，随着15%Na2CO3溶液用量的不断增加，吸光值也增加，当达到4.0mL时，吸光值最大，大于4.0mL后，呈现下降的状态，所以选择15%Na2CO3溶液用量为4.0mL。Na2CO3溶液是Folin－Ciocalteu法测定多酚反应中的缓冲液，孙宏［15］等通过对分光光度法测定天然多酚类物质的研究表明，多酚类物质的显色对Na2CO3溶液用量的依赖性较大。

图2 碳酸钠浓度对多酚含量测定的影响Fig.2 Effect of sodium carbonate concentration on the determination of polyphenol content

图3 15%碳酸钠用量对多酚含量测定的影响Fig.3 Effect of 15%of the sodium carbonate amount on the determination of polyphenol content

2.2.3Folin－Ciocalteu试剂用量的确定Folin－Ciocalteu试剂与多酚类物质结合，在碱性条件下呈现蓝色，Folin－Ciocalteu试剂对反应显色效果的影响如图4所示。

图4 Folin－Ciocalteu用量对多酚含量测定的影响Fig.4 Effect of Folin－Ciocalteu amount on the determination of polyphenol content

随着Folin－Ciocalteu试剂用量的增加，溶液的吸光值也随之增大，当Folin－Ciocalteu试剂用量为1.0mL时，吸光值达到最大，大于1.0mL时，吸光值呈现平稳趋势，所以Folin－Ciocalteu试剂用量为1.0mL。

2.2.4 反应温度的确定 从图5结果可以看出，反应温度在30℃时，吸光值最大，温度过高时，多酚类物质容易氧化，吸光值呈现下降的趋势，因此，最佳反应温度为30℃。

2.2.5 显色时间的确定 多酚类物质与显色剂的反应需要一定的时间，当达到一定时间以后，由于部分多酚被氧化［16］，吸光值逐渐减小。从图6结果可以看出，在1.5h时，吸光值最高，表明核桃外果皮中含有的多酚物质与显色剂已经完全显色，因此显色时间选择为1.5h。

图5 反应温度对多酚含量测定的影响Fig.5 Effect of reaction temperature on the determination of polyphenol content

图6 显色时间对多酚含量测定的影响Fig.6 Effect of color time on the determination of polyphenol content

2.3 标准曲线的建立

以没食子酸标准液的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标作图，结果如图7所示。线性回归得没食子酸浓度(x)与吸光度(y)的关系:y=0.1031x+ 0.0793，R2=0.9996，线性关系良好。

图7 核桃外果皮总多酚测定的标准曲线Fig.7 Standard curve of walnut husk polyphenol

2.4 方法评价

2.4.1 精密度实验 按照1.2.3中确定的最佳条件实验，重复测定没食子酸标准液5次，计算结果见表1。相对标准偏差RSD为1.58%，表明该方法测得核桃外果皮总多酚的精密度较高。

表1 精密度实验结果(n=5)Table 1 Result of precision test(n=5)

2.4.2 稳定性实验 按照1.2.3中确定的最佳条件实验，避光放置0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0h，计算结果见表2。相对标准偏差RSD为2.50%，能够满足样品分析的要求。

表2 稳定性实验结果(n=7)Table 2 Result of stability test(n=7)

2.4.3 重复性实验 取5份1.0mL样品液，按照1.2.3中确定的最佳条件实验，计算结果见表3。相对标准偏差 RSD为1.86%，表明该方法重复性较好。

表3 重复性实验结果(n=5)Table 3 Result of repetitive test(n=5)

2.4.4 加标回收实验 结果如表4所示。平均加标回收率为100.2%，最高加标回收率为101.2%，最低为99.4%，RSD为0.91%，表明该方法具有较高的准确性和可靠性。

表4 回收率实验Table 4 Recovery of experiment

2.4.5 核桃外果皮总多酚含量的测定结果 测定样品的吸光度为0.761，根据式(1)，计算出样品核桃外果皮多酚含量为3.306mg/g。

3 结论与讨论

建立了测定核桃外果皮中总多酚含量的Folin－Ciocalteu比色法，本方法具有操作简单，效率高、设备要求低、精密度高、稳定性和重复性好等优点，适用于核桃外果皮中总多酚的含量测定。

比色法中采用普鲁士兰法测定核桃外果皮中多酚类物质时数值不稳定，准确性差，而且生成的普鲁士兰对实验器皿染色，难以清洗［5］，本实验建立的方法避免了此类问题。

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Determination of total polyphenol in walnut husk with improved Folin－Ciocalteu colorimetry

XU Jia1，XIN Li－fang1，ZHANG Rui－ting1，WANG Hua－bin1，FU Li2，*
(1.College of Food Science and Pharmaceutical Science，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China;
2.Department of Biology，Hanshan Normal University，Chaozhou 521041，China)

Objective:To set up an assay method for the determination of total polyphenol in walnut husk.Method:The determination conditions of total polyphenol content in walnut husk including the detection wavelength，the amount of sodium carbonate solution，Folin－Ciocalteu reagent，reaction temperature and time were studied and gallic acid was used as a standard.Results:The standard curve was linear in the range of 1～7μg/mL(y=0.1031x+0.0793，R2= 0.9996)and the optimum conditions for determining total polyphenol in walnut husk were as followed:1.0mL of the walnut husk extract polyphenol，1.0mL of Folin－Ciocalteu reagent dosage and 4.0mL of 15%sodium carbonate solution，treatment at 30℃for 1.5h，the average recovery was 100.2%(RSD=0.91%).Under these conditions，the total polyphenol content of walnut husk was 3.306mg/g.Conclusion:This method was simple and quick，the result was accurate，repeatable and stable.It can be used for the determination of total polyphenol content in walnut husk.

walnut husk;total polyphenol;determining content;colorimetric conditions

TS207.3

A

1002－0306(2012)06－0060－04

2011－05－03 *通讯联系人

徐佳(1985－)，女，在读硕士，研究方向:食品生物技术。

国家“十一五”科技支撑计划项目(2007BAD36B04);新疆维吾尔自治区高效科研计划科学研究重点项目(XJEDU2008I13)。