冷胁迫对冷冻干燥罗伊氏乳酸杆菌细胞膜流动性的影响

李宝坤，田丰伟，刘小鸣，赵建新，张 灏，宋元达，陈 卫，*

(1.江南大学食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122; 2.石河子大学食品学院，新疆石河子832000)

冷胁迫对冷冻干燥罗伊氏乳酸杆菌细胞膜流动性的影响

李宝坤1，2，田丰伟1，刘小鸣1，赵建新1，张 灏1，宋元达1，陈 卫1，*

(1.江南大学食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122; 2.石河子大学食品学院，新疆石河子832000)

以DPH(1，6－二苯基－1，3，5－己三烯)为荧光探剂，优化了测定罗伊氏乳酸杆菌细胞膜流动性的条件，其最佳测定条件为:激发波长360nm，发射波长430nm，菌浓度OD 0.8，30℃孵育时间为20min。同时研究冷胁迫处理对冷冻干燥存活率。细胞活力及细胞膜流动的影响，研究表明冷胁迫能改善乳酸菌的冷冻干燥存活率，同时在一定的条件下，冻干后细胞的流动性也有所改变，说明经过一定的冷胁迫处理后，增加了细胞的抗性，从而提高细胞的冷冻存活率。

冷胁迫，罗伊氏乳酸杆菌，DPH，细胞膜流动性，冷冻干燥

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri) 本实验室保存;培养基 MRS;1，6－二苯基－1，3，5－己三烯DPH，Aldrich公司;四氢呋喃、其他试剂 均为分析纯。

650－60荧光分光光度计 日本，日立有限公司;冷冻干燥机 美国，LABCONCO有限公司;2450紫外－可见光分光光度计 岛津国际贸易(上海)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 胁迫处理 菌体培养18h(稳定前期)后，经过离心浓缩，加入15%蔗糖(w/v)作为保护剂，分装为9份，其中1份立即在－80℃预冻，其余分别放在4℃与10℃进行冷胁迫处理，经过1、2、3、4h处理后，放入－80℃预冻后进行冷冻干燥

1.2.2 冻干存活率计算 将冻干后的菌粉用PBS复水至冻干前相同体积，采用MRS倒平板法，37℃下培养48h，计数。实验重复3次，每次实验3个平行。根据NA/NB×100%计算存活率，NA是冻干后细胞数，NB为冻干前细胞数。

1.2.3 细胞膜流动性的测定 采用荧光双折射法测定细胞膜流动性。用四氢呋喃配制成2mmol/L DPH贮备液，使用前用PBS(pH 7.0)稀释至2μmol/L备用。取2mL菌悬液(适宜菌浓度)离心后弃上清。加入2mL DPH试剂，混合均匀，在30℃条件下温浴一段时间，然后，在8000r/min条件下离心去上清，加入2mL PBS混合均匀，进行荧光测定。选择合适的激发波长，发射波长，选择适当的狭缝(5mm)和灵敏度，非标记细胞为空白对照。

荧光偏振(P)和细胞的平均微粘度(η)的计算公式如下:

IVV和IVH分别表示:激发光为垂直方向的偏振光，而发射光分别为垂直和水平方向的偏振光时测得的荧光强度;G为光栅矫正因子(G=IVH/IHH)，IHV和IHH是激发光为水平方向的偏振光，而发射光分别为垂直和水平方向的偏振光时测得的荧光强度。P和η越大说明细胞膜流动性越小。

1.2.4 荧光双折射法测定罗伊氏乳酸杆菌细胞膜流动性条件优化 以360nm为激发波长对DPH溶液，未标记染料的空白菌体溶液和用DPH标记的菌体分别扫描，以确定发射波长。通过不同菌浓度(OD值)标记的样品的比较确定合适的菌浓度。将同一组标记的菌体用不同的温浴时间处理，通过实验确定最佳温浴时间。

1.2.5 数据处理 细胞膜流动性的数据利用DPS7.05，采用Duncan新复极差法(SSR)多重比较，结果以±s表示，P＜0.05为差异显著。

2 结果与讨论

2.1 膜流动性条件的优化

2.1.1 DPH标记菌体发射波长的确定 选择360nm为激发波长，分别扫描了含有2μmol/L DPH溶液、未标记菌体(OD为0.2)及标记菌体的荧光发射光谱，结果见图1～图3。

从图1，图2可以看出没有加菌体时的染料和未加染料的菌体最高峰都是414nm，图3为加了染料标记的菌体，其最高峰移至430nm，说明430nm的波峰是由荧光激发的，而在PBS中2×10－6mol/L的DPH是没有荧光的，只有菌体也不能激发430nm的荧光波峰。当DPH掺入到细胞膜脂的烃链区后，介质粘度变大，顺反异构化受到抑制，从而成为唯一能发荧光的全反构型。结合后的DPH，其最大发射峰位在430nm。以360nm为激发波长，确定发射波长为430nm。

图1 染料DPH荧光光谱Fig.1 Fluorescence spectrum of DPH

图2 未标记菌体(OD 0.2)荧光光谱Fig.2 Fluorescence spectrum of unlabeled LAB

图3 DPH标记菌体(OD=0.2)荧光光谱Fig.3 Fluorescence spectrum of labeled LAB

2.1.2 DPH标记菌体菌浓度的确定 在激发波长360nm，发射波长430nm条件下分别测定 OD600为0.1～0.9。

由图4可以看出，菌浓度在OD小于0.6的情况下，荧光强度随着菌浓度的上升而增强，当OD大于0.8时，荧光强度趋于稳定，因此，确定最适当的菌浓度为OD 0.8。

2.1.3 孵育时间对荧光强度的影响 在上述条件下，将菌体孵育10、20、30、40min，测定其荧光强度，结果如图5所示。

由图5可见，荧光强度在20min后即达平衡，30min后开始下降，这可能是DPH自身淬灭的结果。故选择样品在30℃下温育20min。

通过以上确立了罗伊氏乳酸杆菌细胞膜流动性实验的条件:激发波长360nm，发射波长430nm，菌浓度为OD 0.8，孵育时间为20min。在此条件下测定罗伊氏乳酸杆菌荧光光谱如图6所示。

图4 菌浓度对荧光强度的影响Fig.4 Effect of OD on fluorescence intensity

图5 孵育时间对荧光强度的影响Fig.5 Effect of time on fluorescence intensity

图6 最佳条件下DPH标记罗伊氏乳酸杆菌荧光光谱Fig.6 Fluorescence spectrum of labeled LAB under the optimum conditions

通过图6可以看出，在最佳条件下，菌体的荧光发射光谱发生了显著的变化，在430nm处荧光强度高达18.96。

2.2 冷胁迫处理对菌体存活率的影响

菌体按照方法1.2.1处理后进行冷冻干燥，结果见图7。

图7 冷胁迫对冷冻干燥乳酸菌存活率的影响Fig.7 Effect of stress on the survival rate of LAB during freeze－drying

通过图7可以看出经过不同的胁迫处理后，冷冻干燥罗伊氏乳酸杆菌的存活率有一定的差异，其中以4℃、3h最高为91.90%，其次为4℃、2h处理为89.16%，分别比未处理组85.77%提高了6.13%，3.39%。说明经过胁迫处理后可以改善菌体的抗冷冻干燥的能力。

2.3 冷胁迫对菌体活力及细胞膜流动性的影响

在最适实验条件，测定冷胁迫条件下冷冻干燥后菌种的活力(发酵MRS培养基6h)及细胞膜流动性，实验数据用 DPS7.05采用Duncan新复极差法(SSR)多重比较，结果以±s表示，P＜0.05为差异显著，结果如图8所示。

图8 冷胁迫对乳酸菌活力及细胞膜流动性的影响Fig.8 Effect of cold stress on the membrane fluidity and cell viability of LAB during freeze－drying

从图8可以看出，不同的胁迫温度和处理时间对冻干后菌体活力，细胞膜的荧光偏振度(P)和细胞膜微粘度(η)的影响不同，但是变化的趋势较为一致，其中经过4℃、2h处理后，冷冻干燥菌体的荧光偏振度(P)和细胞膜微粘度(η)最小，分别为0.328 ±0.007，5.05±0.35，说明此时的细胞膜流动性最好。同时，菌体发酵的pH最低为5.35，说明菌体的活力最好。与之相反的是经过4℃、4h处理后，P和η分别达到最大，此时的菌体活力最小，以上结果说明细胞膜流动性与菌体活力有一定的相关性。

3 结论

利用DPH为荧光探剂，测定罗伊氏乳酸杆菌细胞膜流动性的方法是可行的，其最佳测定条件为:激发波长360nm，发射波长430nm，菌浓度为OD 0.8，30℃孵育时间为20min。罗伊氏乳酸杆菌经过4℃、3h和4℃、2h冷冻胁迫处理后，提高了菌体冷冻干燥的存活率。通过分析冷冻干燥后菌体的细胞膜流动性及细胞活力，细胞膜流动性与细胞活力具有一定的相关性，其中菌体经过4℃、2h冷冻胁迫后菌体的活力及流动性都相对于对照组有所提高。

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Effect of cold stress on membrane fluidity of Lactobacillus reuteri during freeze－drying

LI Bao－kun1，2，TIAN Feng－wei1，LIU Xiao－ming1，ZHAO Jian－xin1，ZHANG Hao1，SONG Yuan－da1，CHEN Wei1，*
(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China;2.School of Food，Shihezi University，Shihezi 832000，China)

The 1，6－diphenyl－1，3，5－hexatriene(DPH)was used as fluorescence probe to label the membrane of Lactobacillus reuteri.The optimum conditions were established to measure the membrane fluidity of L.reuteri by labeling with DPH:excitation wavelength 360nm，emission wavelength 430nm，adjust OD600of L.reuteri to 0.8，incubateed at 30℃ in the dark for 20 min.Meanwhile，the survival rates，viability and membrane fluidity of L.reuteri were measured after cold stress during freeze－drying.The results showed that the survival rates of freeze－drying Lactobacillus reuteri were improved by cold stress.At same time，the membrane fluidity was changed.The results implied that cold stress could improve cryotolerance of L.reuteri and prevent damage of freeze－drying.

cold stress;Lactobacillus reuteri;DPH;membrane fluidity;freeze－drying

TS201.2

A

1002－0306(2012)08－0137－04

细胞膜是细胞生命活动的必需组织，细胞膜的正常生理功能有赖于膜结构的完整和膜脂的恒定流动，细胞膜的流动性是其重要的动力学特征，与生物体的生命活动密切相关［1］。适宜的流动性是保证细胞处于正常生理状态的重要条件。流动性的改变给细胞正常的生理活动带来不利的影响，使细胞膜生理功能发生障碍［2－4］。冷冻干燥是益生菌发酵剂最常用的一种保藏方式，在冷冻干燥的过程中会改变细胞流动性，引起细胞活力的下降［5－6］。近年来，一些研究发现，在冷冻干燥前进行胁迫处理如冷胁迫，热胁迫处理后可以提高菌种的冷冻干燥存活率［7］。1，6－二苯基－1，3，5－己三烯(DPH)是一种比较敏感的荧光探剂常用于研究膜脂流动性［8］，本研究将利用DPH对罗伊氏乳酸杆菌进行标记，测定细胞膜流动性，其研究目的主要有三个方面:a.优化DPH荧光标记罗伊氏乳酸杆菌细胞膜流动性测定条件;b.评价冷胁迫对罗伊氏乳酸杆菌冷冻干燥存活率的影响;c.分析冷胁迫后冷冻干燥乳酸菌细胞膜流动性及活力的相关性，从细胞水平上分析冷胁迫对冷冻干燥乳酸菌的作用机制。

2011－08－23 *通讯联系人

李宝坤(1979－)，男，讲师，在读博士研究生，研究方向:食品微生物学。

国家自然基金(20836003，30871952);“十一五”国家科技支撑计划重点项目(2009BADC1B02，2009BADB9B05);“十二五”国家“863”计划(2011AA100901，2011AA100902)。