Livin和Caspase-3在喉鳞癌组织中表达的意义及相关性分析

徐 勤 高 珊

喉鳞癌是耳鼻咽喉科常见的恶性肿瘤。肿瘤的发生是细胞增殖与细胞凋亡失衡所致，受细胞内多种因素控制。Livin是一种特殊的细胞凋亡抑制剂，具有抗凋亡特性。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-3是细胞凋亡过程中的关键蛋白酶，被认为是凋亡的执行者。本实验从蛋白水平探讨Livin和Caspase-3这2种蛋白在喉癌组织中的表达水平及其相关性分析，进一步探讨其在喉癌发生、发展过程中的变化规律及其与临床病理特征的关系，为喉癌的预防、预后评估及基因治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集我院耳鼻咽喉科2008年1月—2010年12月住院手术的62例喉癌患者的喉癌组织标本，所有肿瘤组织均经病理学确诊为鳞状细胞癌，全部病例术前均未行放疗、化疗，临床资料完整。喉癌患者中男52例，女10例；年龄42～76岁,中位年龄61岁，其中＜60岁者22例，≥60岁者40例；有淋巴结转移者26例，无淋巴结转移者36例（有无淋巴结转移根据术后病理而定）；病理学分级：G1（高分化）组30例，G2（中分化）组 20 例，G3组（低分化）12 例；临床分期采用国际抗癌协会 （UICC）2010年公布的TNM分类分期标准：Ⅰ～Ⅱ期28例，Ⅲ～Ⅳ期34例；声门上型 40例，声门型22例；发病前吸烟史（每日＞20支）20年以上者48例，为吸烟组，余14例为对照组。收集30例声带息肉患者活检组织做为对照组，并经病理证实为炎症或正常黏膜。所有标本取材后常规石蜡包埋，用于后续实验。

1.2 试剂和仪器耗材 兔抗人Livin单克隆抗体 （武汉博士德BA1743）、兔抗人Caspase-3单克隆抗体 （北京中衫金桥ZA-0420）、辣根酶标记山羊抗兔IgG抗体 （中杉金桥ZB-2301）、即用型DAB显色试剂盒(购自福州迈新生物技术开发有限公司)。显微镜（日本OlympusBX40F4）、荧光显微镜（日本Olympus）、显微照相系统（日本 Olympus）。

1.3 方法 采用免疫组织化学SP法进行染色，具体步骤如下：石蜡切片（5μm），常规脱蜡至水，3%过氧化氢室温孵育10 min，清除内源性过氧化物酶活性，在微波炉里抗原修复15 min，室温放置 40 min，PBS冲洗 3次×5 min，小牛血清封闭 10 min，滴加一抗 50 μL（1∶100 工作液）4 ℃过夜，PBS 洗 3次×5 min，滴加二抗，室温孵育15 min，PBS洗3次×5 min，DAB显色5 min，终止显色，蒸馏水冲洗，苏木素复染，透明，封片，镜检。

1.4 结果判定 Livin、Caspase-3主要表达于细胞浆，部分位于细胞核。实验以PBS代替一抗作为阴性对照，以已知喉癌阳性组织切片为阳性对照。以细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应，并采用Volm双评分法进行判定。在染色均匀的肿瘤区，选取5个高倍镜视野（×200），一方面按阳性细胞百分率（A值） 评分：＜25%为1分，25%～50%为2分，＞50%为3分；一方面按染色强度(B值)评分：不着色为0分，浅棕黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。将染色阳性细胞数（A值）与染色强度（B 值）相加判断结果：阴性（-）：0 分，弱阳性（+）：1～2 分，中度阳性（++）：3～4 分，强阳性（+++）：5～6 分。

1.5 统计学方法 所有数据结果经Excel数据库整理，应用SPSS 13.0统计软件进行分析。等级资料采用秩和检验，计数资料采用χ2检验。采用 Spearman等级相关分析 Livin和Caspase-3表达的相关性。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Livin在喉癌组织、声带息肉组织中的表达 在62例喉癌标本中，Livin的阳性表达率为67.74%，高于声带息肉组织的6.67%，差异有统计学意义 （Z=3.778，P＜0.01)，见表1，图1、2。

Table 1 The expression of Livin in larynx squamous cell carcinoma and polyp of vocal cord表1 Livin在喉癌组织、声带息肉组织中的表达情况例（%）

2.2 Livin与临床病理指标间的关系 62例喉癌组织中，Livin的表达在淋巴结有无转移、不同临床分期及不同分化程度之间的差异有统计学意义 （P＜0.05），在不同临床分型、有无吸烟史、不同年龄及性别方面的差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

Table 2 The relationships between Livin and Caspase-3 expression and clinical pathological characteristics in laryngeal squamous cell carcinoma表2 Livin和Caspase-3蛋白表达与临床病理指标间的关系 例（%）

Figure 1 The high expression of Livin in larynx squamous cell carcinoma（SP×200）图1 Livin蛋白在喉鳞癌组织中的高表达（SP×200）

2.3 Caspase-3在喉癌组织、声带息肉组织中的表达情况 在喉癌组织标本中，Caspase-3阳性表达率仅为51.61%，低于声带息肉组织的86.67%，差异有统计学意义（Z=2.485，P＜0.05），见表3，图3、4。

Figure 2 The low expression of Livin in polyp of vocal cord（SP×200）图2 Livin蛋白在声带息肉组织中的低表达（SP×200）

Table 3 Expressions of Caspase-3 in laryngeal squamous cell carcinoma and polyp of vocal cord表3 Caspase-3在喉癌组织、声带息肉组织中的表达情况例（%）

Figure 3 The low expression of Caspase-3 in laryngeal squamous cell carcinoma（SP×200）图3 Caspase-3蛋白在喉鳞癌组织中的低表达（SP×200）

Figure 4 The high expression of Caspsee-3 in polyp of vocal cord（SP×200）图4 Caspsee-3蛋白在声带息肉组中的高表达（SP×200）

2.4 Caspase-3蛋白阳性表达与临床病理指标间的关系 在62例喉癌组织中，Caspase-3蛋白的表达在淋巴结有无转移、不同临床分期及不同分化程度之间的差异有统计学意义（P＜0.05），在不同临床分型、有无吸烟史、不同年龄及性别方面的差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

2.5 Livin与Caspase-3的相关性 Livin表达阳性的42例喉癌组织中，Caspase-3阳性20例（47.62%）；Livin表达阴性的20例喉癌组织中，Caspase-3阳性12例（60.00%）。Livin与Caspase-3在喉癌组织中的表达呈负相关（rs=-0.448，P＜0.05）。

3 讨论

Livin是凋亡抑制蛋白家族（inhibitor of a apoptosis protein,IAPs）中的成员，于2002年从人类基因组cDNA文库中克隆获得。Livin基因位于人染色体20q13.3，全长4.6 kb，其含有IAPs家族成员所特有的凋亡抑制蛋白重复序列（BIR）和一个羧基端环指结构域（RING结构域）。在正常组织中未见表达及低表达，而在肿瘤组织中高度表达[1]。研究显示，Livin在多数恶性肿瘤中高表达，如骨肉瘤、结肠癌、膀胱癌等[2-4]。Caspase蛋白酶家族即半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶，是包括人类在内的哺乳动物细胞凋亡的关键酶类。Caspase-3是Caspase家族成员中最重要的效应因子，处于凋亡有序级联反应的下游，大多数触发细胞的因素最终均需要通过Caspase-3介导信号传导途径而导致细胞凋亡[5]。Caspase-3广泛表达于正常人体组织和多种肿瘤组织中。已有研究显示，Caspase-3在肿瘤中的表达较正常组织明显降低[6-7]。Livin和Caspase-3均作为凋亡通路中的重要作用蛋白，Livin抑制细胞凋亡的机制有：在抑制Caspase介导的凋亡途径中，Livin可以直接抑制核心蛋白Caspase-3的活性，阻断其级联反应，从而抑制凋亡进程[8]。其含有BIR2功能区的凋亡抑制蛋白具有与Caspase-3直接结合的功能，而抑制其凋亡活性；还可与Caspase-7、Caspase-9结合阻碍多种途径诱导的细胞凋亡；还可以激活TAK1/JNK1信号传导途径发挥抗凋亡作用。Crnkovic-Mertens等[9]利用siRNA技术干扰宫颈癌Hela细胞中内源性Livin的表达，发现内源性Livin的表达受到干扰后，可有效抑制Hela细胞生长，并且在凋亡过程中发挥了重要的作用。同样，其他一些实验结果表明在肺癌、胃肠癌、乳腺癌患者血清中检测到抗Livin抗体，而且在肿瘤坏死转移灶中发现带有Livin特异性的CD4+与CD8+T细胞浸润，这些现象又从侧面提示Livin可能既参与恶性肿瘤生长、增殖过程，也可能参与诱导机体产生细胞免疫和体液免疫应答[10-12]。

已有一些研究表明Livin和Caspase-3在细胞癌变过程中的相互作用关系。Liu等[13]研究证实了Livin通过抑制Caspase-3活性而抑制细胞凋亡，从而促进恶性肿瘤生长。随丽娜[14]通过对口腔白斑及口腔鳞状细胞癌中Livin和Caspase-3蛋白的表达研究，发现Livin和Caspase-3不仅在口腔白斑组织与口腔鳞状细胞癌中的表达具有显著差异，而且Livin和Caspase-3的表达呈负相关。卓贤露等[15]检测喉鳞状细胞癌Livin的阳性表达率为70.73%，显著高于正常组织，同时Livin在喉鳞状细胞癌中阳性率与淋巴结转移有关。谢洪等[16]的研究发现Caspase-3在喉鳞状细胞癌组织中的表达明显低于正常组织中。本研究结果显示，喉鳞癌组织中Livin阳性率高于声带息肉组织，Caspase-3阳性率低于声带息肉组织，与以上文献报道一致。本研究结果还显示在淋巴结有无转移、不同临床分期及不同分化程度之间，Livin和 Caspase-3的表达差异有统计学意义。Livin与Caspase-3在喉癌组织中表达呈负相关（rs=-0.448）。表明Livin基因可能通过抑制肿瘤细胞凋亡，在喉鳞癌的发生发展过程中起重要作用，Livin的阳性率随着喉鳞癌的淋巴结转移阳性率升高而增高，表明Livin对判断淋巴结转移具有重要价值。通过多年大量临床观察及研究结果表明，淋巴结转移是影响喉癌预后的最主要因素。不能对其侵袭转移进行早期准确预测是导致治疗失败和难以客观评估预后的主要原因，Caspase-3的表达下调可以作为反映恶性肿瘤生物学行为及预后的生物学指标[17]。Elaliz等[18]检测胃肠道恶性肿瘤及健康对照者血清中抗Livin抗体，认为Livin可能成为新的胃肠道恶性肿瘤检测抗原。El-Mesallamy等[19]在急性白血病患者治疗过程中检测Livin表达量并进行患者缓解率及预后分析后认为Livin可以作为急性白血病预后判断指标之一。通过对Livin与Caspase-3关系的进一步研究，帮助人们进一步认识肿瘤转移的特征，提高对肿瘤临床分期和预后的判断水平，以更好地指导治疗及监测治疗效果。

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