肾组织中足细胞标志物synaptopodin的表达与肾脏损害关系的临床意义

颜妍 杨琪 潘涛 马路 汪建国 周柱亮 刘畅

(北京军区北戴河疗养院全军肾脏病中西医结合治疗中心，066100)

肾小球脏层上皮细胞(足细胞)是肾小球固有细胞之一，参与肾小球滤过膜屏障的形成，同时也是终末分化细胞，一旦脱落后缺乏增殖再生能力，造成肾小球基底膜的不可逆性损伤[1]。在足细胞上存在多种特异性标志物，如synaptopodin、WT-1、GLEPP-1、nephrin、podocalyxin及 C3b受体等[2]。其中synaptopodin是一种与肌动蛋白微丝偶联的蛋白，其富含脯氨酸，是一种线状蛋白质，分子量为73.7 kDa，在机体内只表达于肾小球的足细胞和后脑的突触内。它的功能尚不清楚，初步研究认为它在足突活动中发挥重要作用。既往研究表明，在多种肾小球疾病进展过程中均涉及到足细胞的异常变化，这点在糖尿病肾病的研究中也日益得到重视[3-4]。本研究在我们前期研究工作的基础上[5]，采用间接免疫荧光双标记技术，观察synaptopodin和WT-1在糖尿病肾病患者肾组织中的表达并探讨其意义。

1 材料和方法

1.1 研究对象 选取2000-05—2010-05 10年间在我院经肾活检明确诊断为糖尿病肾病的2型糖尿病患者的肾活检组织标本，共35例，其中男24例，女11例，平均年龄(49.3±12.4)岁。肾穿刺活检组织经甲醛固定、石蜡包埋，2 μm厚度切片，行HE、PAS、PASM和Masson三色染色，根据组织病理改变特点分为弥漫性系膜硬化组(n=20)和结节性硬化组(n=15)。患者肾活检时的年龄、病程、空腹血糖(FBG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、血肌酐(SCr)、24 h尿蛋白定量(TUPr)和评估的肾小球滤过率(eGFR)经MDRD公式计算。正常对照组7例，选自因肾脏肿瘤而行切除的肾脏，所取肾组织标本远离肿瘤部分。

1.2 肾组织内synaptopodin和WT-1的表达检测

1.2.1 间接免疫荧光双标记法 石蜡切片脱蜡，微波抗原修复(95℃，10 min)；10%小牛血清封闭，室温，20 min；加小鼠抗人synaptopodin单克隆抗体(购自美国Maine生物技术公司)，4 ℃，12 h，PBS洗片，5 min×3，加FITC标记的兔抗小鼠IgG(购自北京中杉金桥生物技术公司)，室温，20 min，PBS洗片，5 min×3；加兔抗人WT-1多克隆抗体(购自美国Santa Cruz公司)，4 ℃，12 h，PBS洗片，5 min×3，加罗丹明标记的羊抗兔IgG(购自北京中杉金桥生物技术公司)，室温，20 min，PBS洗片，5 min×3；封片。

1.2.2 激光共聚焦荧光显微镜观察并进行定量分析 激光共聚焦荧光显微镜为Bio-Rad型(美国，Bio-Rad公司)，采用双通道扫描采集图像，FITC的激发光波长为488 nm，罗丹明的激发光波长为543 nm，通过双荧光集成图像观察synaptopodin和WT-1阳性染色的分布。用Imagerpro 5.0图像分析软件分别测量10个肾小球面积(μm2)及每个肾小球内synaptopodin和WT-1阳性面积(μm2)，计算每个肾小球synaptopodin和WT-1阳性面积百分比，取其平均值作为二者的表达指标[6]。

1.2.3 统计分析 数据以均数±标准差表示，采用非配对t检验；synaptopodin和WT-1阳性表达与临床指标之间的相关性采用直线相关分析；统计软件为SPSS 11.0，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组不同病理改变的糖尿病肾病患者的临床病理特点 对两组不同病理改变的糖尿病肾病患者的一般临床情况及足细胞计数结果进行统计分析，结果显示，与弥漫性系膜硬化组患者相比，结节性硬化组患者eGFR降低，TUPr和SCr升高，足细胞计数减少(P＜0.05，表1)。

2.2 synaptopodin和WT-1间接免疫荧光双标记检测结果正常对照组内synaptopodin主要呈颗粒状表达于肾小球的基底膜区域(绿色荧光)，而WT-1主要表达于肾小球的足细胞上(红色荧光)。图像分析结果统计分析显示，与正常对照组相比，糖尿病肾病患者肾小球内synaptopodin和WT-1的表达均降低，且结节硬化组较弥漫系膜硬化组降低更为显著(P＜0.05，表2)。双荧光集成图像显示synaptopodin和WT-1的表达变化一致。

表2 synaptopodin和WT-1免疫荧光图像分析结果

3 讨论

有研究表明，与足细胞及其裂孔膜相关的一些分子如synaptopodin、nephrin、podocin、WT-1等的基因突变，可导致某些先天性或家族性肾病综合征或蛋白尿[7]，可见足细胞及其裂孔膜的完整是维系正常肾小球滤过屏障的关键。本研究结果也提示，synaptopodin和WT-1表达减少和消失同样会导致足细胞及其裂孔膜的完整性受损，从而参与蛋白尿和肾小球节段硬化的形成。

研究显示足细胞是肾小球滤过屏障中独特的胰岛素敏感细胞[8]，糖尿病发病过程中最根本的改变是胰岛素对细胞敏感性降低。研究发现糖尿病肾病肾小球结构变化的特征是肾小球基底膜增厚、系膜基质积聚、进而K-W结节形成，使毛细血管滤过面积减少，导致GFR降低，但这种结构变化如何导致蛋白尿增多的机制尚未完全阐明。既往研究认为糖尿病肾病蛋白尿发生的基础首先是血流动力学的改变，继而肾脏局部一些细胞因子，如血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达增多促进了蛋白尿的形成[9-10]。本研究发现，糖尿病肾病患者足细胞数及WT-1的表达均低于正常对照组，且结节性硬化组显著低于弥漫系膜硬化组，由于足细胞在肾小球滤过屏障中的独特作用，也表明在糖尿病肾病的形成和进展过程中存在足细胞损伤。

synaptopodin和WT-1是足细胞分化成熟的标志物，本研究发现，与正常对照组相比，糖尿病肾病患者肾小球内synaptopodin的表达下调，结节硬化组显著低于弥漫系膜硬化组，同时synaptopodin的表达与患者TUPr呈负相关，与eGFR呈正相关，提示synaptopodin表达异常同样参与了糖尿病肾病的进展过程。

synaptopodin表达减少一方面是足细胞数目减少所致，另一方面足细胞各种特异性标志物之间构成了足细胞特有的结构框架，如果任何一种标志物异常均可导致足细胞结构和功能的破坏，由此我们推测在糖尿病肾病形成的早期可能即存在synaptopodin异常，后者参与了足细胞的损伤过程。Blanco等[11]采用血管紧张素转换酶抑制剂类药物对Zucker大鼠进行治疗，结果发现肾小球内synaptopodin的表达上调，故肾素-血管紧张素系统活化是影响糖尿病肾病形成和进展中synaptopodin表达减少的重要因素之一，但在此过程中是否还存在其他调控因素影响synaptopodin的表达尚需进一步研究证实。

综上所述，足细胞的异常对于肾小球疾病的发展及预后产生重要的影响，Synaptopodin等足细胞标志物的发现为今后肾小球疾病的研究提供了新的切入点。synaptopodin表达减少可能参与了足细胞损伤，后者促进了糖尿病肾病的形成和进展。但在此过程中是否还存在其他调控因素影响synaptopodin的表达尚需进一步研究证实。然而我们认为针对足细胞分子标志物的干预将可能成为延缓糖尿病肾病进展的重要治疗措施。

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