超声波提取杏鲍菇多酚工艺的响应面法分析

姚文华，邱承军

（山东省农业干部管理学院，山东 济南 250100）

杏鲍菇多酚（Pleurotus eryngii Polyphenols）是杏鲍菇中多酚类化合物的总称，具有降血脂、降胆固醇、促进胃肠消化、增强机体免疫能力、防止心血管病等功效，对它们的研究有很高的药用和食用价值。酚类的提取方法主要有溶剂提取、超临界CO2提取、微波及超声波辅助提取等。在天然产物提取方面，自Ganzler等最早利用微波萃取法从羽扇豆中提取鹰爪豆生物碱后，该技术已成为天然产品提前的有力工具[1-2]。由于超声波辅助提取法具有方便、快速、简单、安全、易于实现工业化等优点[3-4]，本试验应用超声波技术辅助提取杏鲍菇多酚。通过响应曲面法试验设计探求超声波提取杏鲍菇多酚的最佳工艺，以期为超声波提取杏鲍菇多酚的工业化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

杏鲍菇：市购，置于50℃干燥机中干燥12 h，粉碎，过40目筛，备用。

1.2 试剂

化学试剂：95%乙醇、钼酸钠、浓磷酸、浓盐酸、硫酸锂、溴水、无水碳酸钠、没食子酸等均为化学纯。

1.3 主要仪器设备

UV-2100紫外可见分光光度计：北京瑞利分析仪器公司；FA2104N电子分析天平：北京赛多利分析仪器系统有限公司；KQ-250E型超声波清洗器：昆山市超生仪器有限公司；FW100型高速万能粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；DL102型鼓风干燥箱：上海跃进医疗器械厂；TDL-60B低速台式离心机：上海安亭科学仪器厂。

1.4 方法

1.4.1 常规成分的测定

杏鲍菇多酚：FoLin-CiocaLteu法测定多酚含量。

1.4.2 试验要点

称取1 g杏鲍菇粉末，加入到一定体积（V1）的一定浓度酒精溶液中，超声波浸提法提取一段时间，混匀后取出一定体积（V2）的浑浊液离心，收集上清液，测定其体积（V3），取1 mL上清液按照制备标准曲线的步骤进行操作，根据回归方程测定滤液中杏鲍菇多酚质量浓度（ρ）。杏鲍多酚的提取率=ρ×V3/V2×V1×100。

1.4.3 杏鲍菇多酚条件的确定

影响杏鲍菇多酚提取效果的主要因素有：液料比、提取时间、超声功率、乙醇浓度和温度，因此，根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理[5]，综合单因素影响试验结果可知提取率在乙醇浓度为0%，提取温度为60℃时达到一个峰值，选择提取时间、超声功率、液料比3个因素，在单因素试验的基础上采用三因素三水平的响应面分析方法，试验因素与水平设计见表1。

表1 响应面分析因素与水平Table 1 response surface analysis and level

2 结果与分析

2.1 单因素试验及分析

2.1.1 乙醇浓度对杏鲍菇中多酚提取率的影响

取液料比40 mL/g，超声波功率400 W，温度50℃，振荡提取50 min，研究不同的乙醇浓度对杏鲍菇多酚提取率的影响，结果见图1。

图1 乙醇浓度对杏鲍菇多酚得率影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction rate of polyphenols in Pleurotus eryngii

由图1可知，乙醇浓度0%时，杏鲍菇多酚提取率达到最高，为0.3486%，随着乙醇浓度逐渐升高，多酚提取率反而下降。分析原因，可能是杏鲍菇多酚水溶性较强，醇溶性较弱，因此随着乙醇浓度的增加杏鲍菇多酚得率呈现下降趋势。

2.1.2 液料比对杏鲍菇中多酚物质提取率的影响

取乙醇浓度0%，超声波功率400 W，温度50℃，振荡提取50 min，研究不同液料比对杏鲍菇多酚提取率的影响，结果见图2。

图2 液料比对杏鲍菇多酚得率影响Fig.2 Effect of raw liquid to material ratio on extraction rate of polyphenols in Pleurotus eryngii

由图2可知，液料比对杏鲍菇多酚提取率影响较大，在液料比小于50 mL/g时，杏鲍菇多酚提取率随水量的增加而提高，当液料比达到50 mL/g左右时杏鲍菇多酚提取率达到最大为0.4805%，其后随液料比的增加杏鲍菇多酚提取率下降。分析原因可能是过多的水量稀释液料，在提取过程中增加浪费。另外用水量的增加不利于后续的纯化工作，基于经济方面的考虑控制液料比在50 mL/g左右。

2.1.3 超声波提取时间对杏鲍菇中多酚物质提取率的影响

取乙醇浓度0%，液料比50 mL/g，超声波功率400 W，温度50℃，研究不同超声波振荡提取时间对杏鲍菇多酚提取率的影响，结果见图3。

图3 超声波提取时间对杏鲍菇多酚得率影响Fig.3 Effects of treatment time on extraction rate of polyphenols in Pleurotus eryngii

由图3可知，提取时间小于50 min时，杏鲍菇多酚提取率随时间的增长呈上升的趋势，提取时间50min时，杏鲍菇多酚提取率达到最大为0.6577%；提取时间大于50 min后，杏鲍菇多酚提取率随时间的增长急剧下降。分析原因可能是长时间的超声波作用使杏鲍菇多酚降解；同时超声波时间过长，热量被溶剂吸收，

降低超声波利用率，从而使多酚的提取率下降。因此超声波振荡时间确定在50 min左右。

2.1.4 超声波功率对杏鲍菇中多酚物质提取率的影响

取乙醇浓度0%，液料比50 mL/g，温度50℃，振荡提取时间50 min，研究不同超声波功率对杏鲍菇多酚提取率的影响，结果见图4。

图4 超声波功率对杏鲍菇多酚得率影响Fig.4 Effects of ultrasonic power on extraction rate of polyphenols in Pleurotus eryngii

由图4可知，当超声波功率小于450 W时，随着超声波功率增大，杏鲍菇多酚的提取效率呈上升趋势。当超声波功率为450 W时，杏鲍菇多酚的提取率达到最大为0.6581%；当超声波功率大于450 W时，多酚物质提取率基本走平，超声波功率对杏鲍菇多酚的提取率影响不大，故超声波功率应控制在450 W左右。

2.1.5 超声波提取温度对杏鲍菇中多酚物质提取率的影响

取乙醇浓度0%，液料比50 mL/g，超声波功率450 W，振荡提取时间为50 min，研究不同的超声波提取温度对杏鲍菇多酚提取率的影响，结果见图5。

图5 提取温度对杏鲍菇多酚得率影响Fig.5 Effects of extraction temperature on extraction rate of polyphenols in Pleurotus eryngii

由图5可知，在温度20℃到60℃之间，杏鲍菇多酚提取率随温度的升高而提高，在60℃时杏鲍菇多酚提取率达到最大，为0.6623%。超过60℃后提取率呈持平趋势。表明达到一定温度后杏鲍菇多酚提取率并不会因温度升高而提高。因此确定杏鲍菇多酚提取最佳温度为60℃。

2.2 响应面试验结果与分析

2.2.1 响应面试验设计结果与分析

对液料比Z1、超声功率Z2和提取时间Z3作变换如下：A＝（Z1－50）/10，B＝（Z2－450）/50，C＝（Z3－50）/10，以A、B、C为自变量，以杏鲍菇多酚提取率为响应值（Y）设计试验方案及3次平行试验，结果见表2。

2.3 模型的建立及其显著性检验

运用Minitab数据统计分析软件使用已编码单位对试验数据进行多元回归拟合，得到杏鲍菇多酚提取率（Y）对液料比（A）、超声功率（B）和提取时间（C）的二次多项回归模型为：

表2 杏鲍菇多酚超声波提取试验方案与试验结果Table 2 Test designs and extraction results of ultrasonic extraction process of polypenols in Pleurotus eryngii

Y=1.11240-0.00681A+0.08409B+0.01023C-0.10461A2-0.26371B2-0.11824C2+0.02502AB+0.06135AC-0.00225BC。回归模型系数见表10，显著性检验结果见表3。

表3 回归方程偏回归系数的估计值Table 3 Estimated values of the partial regression coefficients ofthe regression model

由表3回归方程系数显著性检验可知，P<0.05说明模型显著；P<0.0001，说明模型极显著。在此试验设计中，二次项 AB、AC 显著，一次项 B、二次项 A2、B2、C2极显著，其余项均不显著。此外，各因素对杏鲍菇多酚得率影响的大小顺序为：超声功率B>提取时间C>液料比A。

由表4回归模型方差分析可见，模型的P＜0.0001＜0.01，本试验所选用的模型具有高度的显著性，失拟项在P=0.05水平上不显著（P=0.693＞0.05），其校正决定系数为0.9888，表明此模型拟合优度好，仅有约1.1%的多酚得率总变异不能由此模型进行解释。可以用此模型来分析和预测杏鲍菇多酚超声波提取的工艺结果[6]。

根据表4回归分析结果作出相应曲面图及等值线图，结果见图6～图8。

液料比A、超声功率B及其交互作用对超声提取杏鲍菇多酚提取率的响应面和等值线见图6。

液料比A、提取时间C及其交互作用对超声提取杏鲍菇多酚提取率的响应面和等值线见图7。

超声功率B、提取时间C及其交互作用对超声提取杏鲍菇多酚提取率的响应面和等值线见图8。

由图6～图8可知，液料比和提取时间之间的交互作用显著，相比较而言，超声功率和提取时间、超声功率和液料比之间的交互作用较小。由图8可知，超声功率对杏鲍菇多酚提取率的影响最大，随着超声功率的增加，杏鲍菇多酚提取率也随之增加。

图6 液料比A、超声功率B及交互作用对杏鲍菇多酚得率的响应面和等值线Fig.6 Response surface and contour plots showing the effects of ratio of solvent to material and ultrasonic power on extraction rate of Pleurotus eryngii Polyphenols

图7 液料比A、提取时间C及交互作用对杏鲍菇多酚得率的响应面和等值线Fig.7 Response surface and contour plots showing the effects of ratio of solvent to material and working time on extraction rate of Pleurotus eryngii Polyphenols

图8 超声功率B、提取时间C及交互作用对杏鲍菇多酚得率的响应面和等值线Fig.8 Response surface and contour plots showing the effects of ultrasonic power and working time on extraction rate of Pleurotus eryngii Polyphenols

表4 回归模型方差分析Table 4 Variance analysis for the regression model

2.4 杏鲍菇多酚提取工艺条件的确定

通过软件Design Expert求解方程，即对模型方程求一阶偏导得如下3式：

式（1）、（2）、（3）联立方程组可以求出模型的极值点：A=-0.001，B=0.160，C=0.042，转换后得 A=49.98，B=458.01，C=50.41。即最优提取条件为：液料比49.98mL/g，超声功率458.01 W，提取时间50.41 min，最大提取率1.11718%，采用该实验条件进行验证实验得到提取率为1.10987%，表明该方程与实际情况符合得很好，响应面法能较好地对影响杏鲍菇多酚的提取工艺进行回归分析和条件化。

3 结论

1）超声波提取杏鲍菇多酚试验中，选择参数主要有液料比、超声功率和提取时间，另外还有提取液浓度和提取温度等因素。本研究通过单因素试验考察液料比、超声功率、提取时间、提取液浓度以及提取温度对杏鲍菇多酚提取率的影响，确定了对实验有较大影响的液料比、超声功率和提取时间3个因素。

2）通过响应面分析法对各因素的最佳水平范围及其交互作用进行了研究和探讨，建立了影响多酚提取率的二次多项数学模型，依据回归分析结果可知，杏鲍菇中多酚提取的最佳工艺条件为：液料比49.98 mL/g，超声功率458.01 W，提取时间为50.41 min，理论上最大提取率为1.11718%，而试验验证提取率为1.10987%。说明该方程与实际情况符合度良好，通过响应面法能较好的对影响杏鲍菇多酚的提取工艺进行回归分析和条件预测。

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[3]严伟,李淑芬,田松江.超声波协助提取技术[J].化工进展,2002(9):649-651

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[5]Box GEP,Hunter W G.Statistics for experiments:An introduction to design,data analysis and model building[M].New York:John Wiley&Sons,Inc,1978:306-336

[6]周纪芗.实用回归分析方法[M].上海:上海科学技术出版社,1990:77-79