DNA条形码—医学媒介生物快速准确鉴定的利器

岳巧云 邱德义 胡 佳 刘国雄

（1.中山出入境检验检疫局 广东中山 528403；2.广东出入境检验检疫局）

1 前言

目前国际上对昆虫种类的鉴定主要是依据成虫的形态学特征，相近种类昆虫的幼虫、蛹、卵等非成虫态的虫体形态特征差异小，有些特征在不同的发育时期不够稳定，根据非成虫态的虫体形态学特征进行种类鉴定很难确保其准确性，并且需要鉴定者具有非常丰富的分类学知识和经验，因此昆虫的非成虫虫态鉴定一直是一个技术难题。在口岸的日常检疫过程中经常会截获大量的医学媒介生物，主要以病媒昆虫为主，这些病媒昆虫往往以成虫、幼虫、蛹、卵等各种虫态以及残缺不全的虫体出现。如果截获的是幼虫、卵、蛹等非成虫虫态，通常需要将其培养成成虫后再进行鉴定，整个检疫鉴定过程时间长达数周；而对于肢体残缺的样本更是鉴定困难，大大加长了检测周期。

近代分子生物学技术的兴起，为古老的昆虫分类学科注入了新的活力。在昆虫学研究领域，分子生物学技术主要应用于系统演化及分类鉴定两方面。昆虫系统演化的研究是从分子水平上找出其种间DNA序列的特异性差异，主要目的为探索昆虫种、属间的相对亲缘关系，同时也为昆虫的分子鉴定奠定了基础。

DNA条形码是一种近年兴起的新技术，它的原理是利用DNA上一段标准的基因片段，作为分子靶标来进行种级水平的物种鉴定。用于条形码技术的DNA片段要具备以下两个特点：①长度适中并容易获得；②保守度适中。线粒体COI基因（Cytochrome Oxidae Subunit I, 细胞色素氧化酶亚基I）在细胞内的拷贝数高，获得技术简单，而且序列非常保守，在物种内不同个体之间有1-2%的差异，而近缘种间的差异大，非常适合作为DNA 条形码技术的分子标记。

2 传统形态学种类鉴定与DNA条形码技术的比较

2.1 传统形态学种类鉴定的局限性

2.1.1 受发育状态的限制

大多数生物，尤其是昆虫主要是根据成虫的外部形态，或者雄虫外生殖器的形态特征进行物种鉴定，卵、幼虫、蛹等非成虫虫态一般需要在实验室内孵化成成虫后才能鉴定。根据虫体发育的速度不同，需要的时间长短不一，但一般需要3-4周的时间，非常费时[1]。

2.1.2 肢体残缺的种类无法准确鉴定

肢体残缺的种类，如果缺失的是主要的鉴别特征，就很容易造成种类鉴定不准确或者根本无法鉴定。

2.1.3 对专家的依赖性高，难免主观判断的影响

物种的形态鉴定历来都是专家的经验和权威性起到很大作用，物种的界定往往以细微的形态特征为依据，因此难免存在主观判断的影响。

2.1.4 生物种类的多样性、复杂性

地球上的生物种类繁多，据联合国环境署最新报告（2011年8月23日华盛顿特区/英国剑桥讯，联合国环境署网页新闻w w w.unep.org/newscenter/default.aspx?DocumentID=2649&Arti cleID=8838），地球上生物种类约870万种。其中650万种陆地生物，220万种海洋生物；780万种动物，30万种植物，60万种真菌。870万种是一个估算值，误差在130万种左右，因此地球生物总数在740万种到1000万种之间，但目前只有120万种为已知的种类[2]。如此繁多的种类，任何专家不可能都熟知。

2.1.5 难以区别近似种

表型可塑性和遗传可变性导致难以区别近似种[3,4]。

2.1.6 数据共享性差

传统的形态分类主要依据标本的外部形态，因此需要将实体标本在专家间传阅，才能确定物种，即使在网络和通讯发达的今天，所谓的远程鉴定，一般的专家很难仅根据图片进行一个物种的确认，大多需要研究实体标本，因此数据的共享性不强。

2.2 DNA条形码技术的优越性

2.2.1 鉴定物种不再受虫态和虫体不完整的限制

当DNA条形码数据库中积累了足够的数据后，对以后截获的卵、幼虫和蛹等非成虫虫态以及肢体残缺不全的物种，可以根据其条形码数据直接和数据库的数据进行对比，即可达到物种鉴定的目的，无需将其在培养成成虫再行鉴定，这样为进一步采取相应的检疫措施节约时间[5]。

2.2.2 对鉴定者的专业技术要求大大降低

培养一个传统的分类工作者往往需要数年的专业培训，并且由于物种数量巨大，大多形态分类工作者仅对某一个类群，甚至一个科或者一个属的物种能精确鉴定，而对其他类群无法鉴定。随着分子生物学技术的发展，DNA提取和扩增技术日渐成熟和发达，测序商品化越来越方便和便宜，分子分类只需工作者接受一定的训练，有简单的分子生物学操作技能。

2.2.3 对外来物种的鉴定将更加准确快速

传统分类者的知识具有专一性和局限性，虽然能准确鉴定本国的物种、自己熟悉的类群，但对外来物种的鉴定则比较困难，必须和国外的分类专家交换标本、交流意见，需要很长时间才能达到鉴定的目的。建立DNA条形码数据库，当数据库中的数据积累到一定程度，这个问题将得到解决，达到外来物种快速准确鉴定的目的。

2.3 DNA条形码技术目前存在的问题

2.3.1 有效数据缺乏

DNA条形码技术的广泛应用目前很大程度上还受数据库数据缺乏的限制，地球上的870万种生物中被DNA条形码编码的仅占很少一部分。截止2013年7月22日，BOLD（生物DNA条形码数据系统，www.barcodinglife.org/index.php/Tax Browser_Home）系统中仅有180683种生物的DNA条形码数据，因此在实际应用中，大量种类不能被直接鉴定。

2.3.2 形态分类与DNA条形码数据脱节

由于多种原因的影响，作为DNA条形码数据投到数据库中的序列，有可能不是形态分类学家正确命名的物种，导致数据库中一些物种的条形码数据不准确，给条形码技术的实际运用带来困难，甚至引起混乱和误会。

2.3.3 有些数据缺乏统一规定，不具可比性

由于过去缺乏统一规定，世界各地的科学家使用的扩增引物不统一，因此得到的基因片段不同、长短不一、质量差别，不具可比性，实用性差，达不到物种比对鉴定的作用。DNA条形码联盟和BOLD系统的建立为解决该问题起到了积极的作用。

3 DNA条形码技术的发展现状

被称为“DNA条形码之父”的加拿大学者Hebert于2003年首次提出DNA条码的概念，他和他的同事选取COⅠ基因的一段序列对动物中7个门、8个目的不同种群进行种类鉴定，发现除腔肠动物Cnidaria外，98%的物种遗传差异在种内为0%-2%，种间平均为11.3%，显示该基因具有较好的鉴定物种作用。据此他提出可以用单一的小片段基因来代表物种，作为物种的条形编码，为全球生物编码[6]。2003年3月，在美国冷泉港召开了题为“TAXONOMY AND DNA”的会议，提出对全球所有动物物种COI基因进行大规模的测序计划；2003年7月，生物DNA条形码专业网站（http：//www.barcodinglife.com）开通，为研究人员提供生物条形码的研究信息；DNA条形码数据库的专业网站barcoding of life data system简称BOLD （http://www.boldsystems.org/）的建立，为利用DNA条形码进行物种鉴定提供了一个先进的平台，Ratnasingham 2007[7]详细介绍了该网站的功能和使用；2004年生命DNA条形码协会（Consortium for the Barcode of Life，CBOL）的成立，致力于发展鉴定生物物种的全球标准，为全球的动物物种鉴定提供服务；2005年达尔文诞辰纪念日，来自全球46个国家220位科学家在伦敦英国自然历史博物馆参加了第一届全球DNA条形码会议，大会对DNA条形码的分类概念、实验技术细节分析以及资料库建立等议题进行了讨论。

DNA条形码理论作为一种新型分类技术引起了分类学界的极大兴趣和支持，同时也由于其缺乏可行的标准而受到怀疑与反对。但随着技术的不断发展和相关软件的开发，DNA序列信息的丰富性以及独一无二的可重复性，DNA条形码必将成为分类学家的有用工具，DNA条形码技术也将成为生物分类发展的必然趋势。目前，DNA条码技术主要应用于种类鉴定、系统发育分析等研究中，然而，不同物种和不同研究需要所选择的目的基因不同。近几年，国内外对DNA条形码进行了广泛的研究和应用。比如，Hebert等(2004)[8]对北美260种鸟类进行了DNA条形码的序列分析，结果表明每种鸟都有一个单独的条形码，不同种之间的变异平均是同种鸟之间变异的19-24倍，而且发现其中4种鸟分别出现了2种不同的COⅠ基因序列，这证明北美鸟类中发现了4个新种；Hajibabaei 等（2005）[9]利用DNA条形码技术对热带的鳞翅目昆虫进行了重新分类；Ball等（2005）[10]尝试用分子条形码鉴别70多种水生蜉蝣；Armstrong等（2005）[11]通过对过去10年间在新西兰口岸截获的毒蛾和实蝇进行COI的一段基因研究发现，一些以前未鉴定出的毒蛾被定到了科级，同时许多实蝇的复合种也被区分，同时他们认为COI基因对于口岸害虫的鉴定很有效并有较好的应用前景。

近几年，尽管我国不断有零星应用DNA条形码技术进行物种鉴定和系统关系进化方面的研究工作，但我国DNA条形码研究起步略晚。近来国家投入资金支持DNA条形码的研究，中科院等科研机构也和国外合作进行此方面的研究；国家自然科学基金于2010年通过了DNA条形码重大课题的论证并立项；国家科技部“十二五”国家科技支撑项目“检疫性有害生物DNA条形码检测数据库建设及应用”已经立项，其中包括“医学媒介生物DNA条形码检测技术及示范应用”国家科技支撑计划课题，致力于全国和输入性医学媒介生物种类的DNA条形码数据的获得并计划将该技术应用到日常检疫的种类鉴定中。

4 应用DNA条形码技术进行物种鉴定的基本流程

4.1 标本的获得和保存

截获的输入性或者本底调查所得医学媒介生物进行种类鉴定，确定凭证标本，制作标本，记录标本的采集、鉴定等信息等并妥善保管凭证标本。凭证标本作为DNA条形码数据的来源，必须与DNA条形码数据为一一对应的关系，因此凭证标本非常重要，一般需要具备以下基本信息：凭证标本名称（可以是确定的准确名称也可以是临时性名称）；凭证标本的采集信息（如采集人、带GPS定位信息的采集地点等）；凭证标本的鉴定信息（如标本鉴定人、保存号和保存地点等）；DNA条形码序列信息（如至少大于500bp的COI片段及序列、PCR引物序列等）；追踪档案（trace files，如测序原始图谱、根据序列建立的系统进化等）。对于医学媒介生物还应该包括携带病原体的主要种类以及与传染病的关系等基本信息。

4.2 基因组DNA的获得

取凭证标本身体的一部分组织，例如蝇、蚊、蠊等医学媒介昆虫取一侧的一条后腿，鼠类等较大型凭证标本可以在制作标本时，取一小块肌肉或者肝脏作为提取基因组DNA的原料（取组织时，原则上不破坏凭证标本的主要形态鉴定特征），利用动物组织基因组DNA提取试剂盒提取凭证标本的基因组DNA。对于馆藏标本，由于馆藏时间、馆藏条件、馆藏方式的不同以及不同身体部位的DNA含量、组织成分的不同，因此需选择使用合适的试剂盒或者自制方法提取基因组DNA，旨在获得高纯度、高质量的模板DNA，以利于后续的DNA扩增。

4.3 PCR扩增

节肢动物尤其是昆虫，获得DNA条形码数据的第一选择引物为动物DNA条形码通用引物，正向引物LCO1490：GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G；反向引物HCO2198: TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA[12]，以基因组DNA为模板进行DNA扩增，反应体系一般为50μL，扩增所用的酶为一般商业Tag酶即可。

4.4 PCR产物的测序

PCR产物纯化后，可以克隆也可以将PCR产物直接交由商业的测序公司进行测序。

4.5 序列的比对和结果判定

测序所得的序列，除去引物序列后，与BOLD系统、NCBI系统或者其他数据库中的数据进行比较，根据序列的相似性和遗传距离判断物种。但序列分歧达到什么程度才能明确为两个不同的物种，还需要进一步探讨，但现有的研究数据表明绝大多数物种的COI序列表现出低的种内遗传差异及相对较高的种间差异。

5 展望

目前，国内外均已开展DNA条形码的研究项目，发展趋势是将DNA条形码与PCR技术、DNA芯片技术相结合，最终目标是建立高通量、快速、低成本、灵敏准确的成套检测技术，通过快速分析一小段DNA分子，可以鉴定出地球上每一个生物物种。DNA条形码是常规分子检测方法的提炼与升华，它使科研和检疫检验工作更加高效率，可使过去只有专家才能掌握的知识变得简便易行，因而更好地服务于大众与社会[13-16]。但是关于利用DNA条形码进行种类鉴定也有不同的观点，如Dasmahapatra 2010[17]指出利用DNA条形码技术鉴定的隐性种有些真实，有些不是，当出现矛盾结果时，应该运用其他分子标记技术如AFLP（扩增片段长度多态性）进行验证。当前DNA条形码运用最多也最成熟的领域是动物鉴定，尤其是节肢动物鉴定，对于植物及细菌、病毒中选用何种基因片段合适还有待进一步研究。在目前情况下DNA条形码技术的应用，不能完全脱离形态分类，尤其是在建立DNA条形码数据库的过程中，脱离形态鉴定的DNA条形码技术将成为无根之水，建立正确的DNA条形码数据需要以准确的形态种类鉴定为前提。目前正处于丰富DNA条形码数据的时期，需要投入大量人力、物力、财力，需要传统形态分类工作者和分子进化工作者相互协作，取长补短，为尽快建立这一通用的国际化鉴定平台做出各自的贡献。

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