内皮细胞膜微粒与脑血管疾病的相关性研究进展*

冯晓敏 ， 秦　超

(1．广西医科大学，南宁　530021；　2.广西医科大学第一附属医院，南宁　530021)

脑血管病是指由于栓塞和血栓形成导致的血管腔闭塞、血管破裂、血管壁损伤或通透性发生改变、凝血机制异常、血液黏度异常或血液成分异常变化引起的脑功能障碍，其发病率、病死率和致残率均很高。目前，世界卫生组织统计全球脑血管疾病每年死亡人数为615万，位列全球十大死因第二，仅次于心血管疾病。因此在对脑血管疾病进行有效治疗的同时，积极开展对脑血管病的预防至关重要。目前可以用各种血液中的生物标志物来诊断感染、血脂异常、糖尿病和急性心肌梗死等，然而，没有特定的血液标志物可用于脑血管疾病的预测或诊断。细胞膜微粒(microparticles, MPs)是在细胞激活或者凋亡的情况下从细胞膜脱落下来的0.1～1 μm的微小碎片[1]。循环血中的MPs可以来自于血小板、白细胞、红细胞、内皮细胞以及内皮祖细胞等[ 2, 3]。大量研究已报道，脑血管病发生主要源自于内皮功能障碍、血管损伤及炎症反应[4]。其中内皮功能障碍导致血栓形成是动脉粥样硬化和脑卒中发生的一个关键因素，同时内皮细胞的功能障碍是由内皮细胞活化或凋亡的程度所决定的。目前已有研究报道循环血中的内皮细胞膜微粒在内皮功能障碍、血管损伤、炎症反应和血栓形成中起着重要的作用，因此，推测循环血中的内皮细胞膜微粒可能成为脑血管疾病的潜在的生物学标记物。本文将对当前关于循环血内皮细胞膜微粒对脑血管病的研究做以下综述。

内皮细胞膜微粒(endothelial microparticles， EMPs)是内皮细胞在多种刺激下激活或者凋亡时从细胞膜脱落到外周血中的小囊泡状物质[5]。1990年Hamilton等[6]将补体蛋白C5b-9和钙离子载体A23187作用于脐静脉内皮细胞后，第一次用流式细胞仪检测出一种<1 μm 的微粒，命名为 EMPs。保留其前体细胞特有的细胞膜、细胞质和细胞核结构，在大小和组成上与其他亚细胞结构如凋亡体(1500～4000 nm)和外染色体(50～100 nm)不同[7-9]。许多研究发现，循环血中的内皮细胞膜微粒的增加可见于多种疾病，如冠心病、多发性硬化、恶性高血压、糖尿病、系统性红斑狼疮、抗磷脂抗体综合征、血栓性血小板减少性紫癜、镰状细胞病和阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)等[10-12]。随后的研究发现在慢性阻塞性肺病、阿尔兹海默病等疾病中也有EMPs水平的增高[13, 14]。因此，内皮细胞膜微粒可能成为多种疾病的新型生物学标志物，对疾病的预测、进展及预后有着重大的指导作用，进而可能为疾病的预防、治疗及防治并发症提供重要的线索。

1　EMPs的形成机制

研究表明，正常健康人体循环血中有少量的EMPs。在多种疾病状态下，内皮细胞膜受某些因素的刺激， 会增加EMPs释放。这些刺激因素包括：①促炎症刺激：TNF(肿瘤坏死因子)-α、LPS(在脂肪酸的存在下)、IL-1α、和CRP(C-反应蛋白)等[15, 16]；②凝血因子：凝血酶和纤溶酶原激活物抑制剂等[17]；③尿毒症的毒素：P-甲酚[18]；④其他刺激血管的因素：如高血糖、血管紧张素II、生长因子剥夺和活性氧自由基(ROS)等[5, 19-22]。最近研究发现，在体内血流剪切力与EMPs的形成也有关系，但在体外实验中未见报道。当前在体外细胞培养的研究中已证实EMPs在内皮细胞活化和凋亡时均可形成，然而，EMPs在体内的形成机制仍待有力的证据证明。

1.1内皮细胞活化EMPs形成首先需要细胞出芽形成膜小泡，当内皮细胞激活时，胞质中钙离子浓度增加，使细胞膜脂类分布有关的酶的活性降低，改变膜脂正常的不对称性，同时抑制磷酸酶，激活钙蛋白酶，使踝蛋白降解导致细胞骨架结构紊乱和重组，导致位于细胞膜内层的磷脂酰丝氨酸暴露于细胞表面，细胞骨架水解，使EMPs释放[23]。

1.2内皮细胞凋亡凋亡细胞产生EMPs与激活时的机制有所不同，细胞凋亡的特点是细胞固缩及DNA的降解。囊泡的形成依赖于细胞骨架的肌动蛋白与肌球蛋白的相互作用，Capsase 3介导的Rho激酶I的激活能调节这个作用[24]。ROCK蛋白被与GTP结合的Rho蛋白激活，促进肌球蛋白轻链的磷酸化，肌球蛋ATP酶激活使肌球蛋白-肌动蛋白丝与细胞质膜连接，且收缩力增加，使细胞收缩[25]，DNA降解，DNA片段从细胞核区域裂解到膜囊泡中，EMPs释放。由此得知，细胞凋亡所形成的EMPs可能含有细胞核的成分。他汀类药物能通过使Rho/ROCK途径失活，抑制EMPs的产生[26]。

内皮细胞膜微粒在内皮细胞活化及凋亡时所形成的机制不同，这也表明其生物学意义可能也不尽相同。

2　 细胞膜微粒的检测方法

目前，尽管循环内皮细胞膜微粒已被证实在多种病理情况下的数量有明显改变，很多研究也在体外实验中提取分离出了EMPs,但是其可靠的识别和量化技术仍然是一个挑战。

目前使用最多的方法是流式细胞学，先通过离心获取乏血小板血浆，再按一定的倍数稀释，加入高特异性荧光标记抗体结合微粒上特定的蛋白抗原成分(EMPs表面表达内皮细胞膜表面抗原，如CD31、CD144 、CD51、CD54、CD106、CD146、CD105、CD62E和CD42等)或加入annexin V结合暴露的磷脂酰丝氨酸，通过检测结合样本的荧光强度即可达到对样品中的微粒进行定量的目的。根据研究者不同的研究目的，选择不同的特异性抗体，常用的抗体有：单抗CD144、 CD51、CD105、CD54、CD62E和CD106或组合抗体CD31/CD42b(内皮细胞及血小板均表达CD31，而CD42b只在血小板表面表达)和CD31/AV等。EMPs的大小通常由1 μm 和2 μm的流式细胞磁珠进行校准。

在体外细胞培养的实验中，内皮细胞在凋亡和激活过程中释放不同抗原表型的EMPs，诱导内皮细胞凋亡时，表达结构性标志的抗体(如 CD31、CD51、CD105)明显升高(且CD31>CD105)，诱导内皮细胞激活时，表达可诱导标志的抗体 (CD54、CD62E、CD106)明显升高(且CD62E>CD54>CD106)，annexin V与暴露于细胞表面的磷脂酰丝氨酸结合，因此annexin V+ EMP在内皮细胞凋亡及激活时都显著升高。因此用流式细胞学法特异性抗体可了解内皮细胞的功能状态，以便为临床提供有用的信息。

流式细胞术作为目前检测微粒的一项重要技术，具有检测设备简单、周期短、可同时检测微粒所表达的两种或多种抗原成分及易于对微粒进行定量、能快速检测大量的样本等优点。然而，这一技术也并非十全十美，在微粒的检测过程中仍存在诸多不足。如EMPs非常小，所带的表面抗原蛋白又是很小的一部分，因此，与抗体结合有一定的限制性，大大减少了被测定EMPs的数量。但目前为止，流式细胞术仍然是最普遍的检测方法。其他检测EMPs的方法还有：酶联免疫吸附试验、功能性分析、细胞微粒的氟硼二吡咯-马来酰亚胺染色法、以细胞微粒蛋白质组学为基础的分析法、激光共聚焦显微镜和电子显微镜和纳米微粒跟踪分析等[27, 28]。

3　内皮细胞膜微粒与脑血管疾病的关系

3.1EMPs与脑血管内皮功能障碍 脑血管内皮功能障碍为脑血管病发病的重要因素，EMPs又是内皮细胞功能障碍的诱导因素之一，因此，研究EMPs对内皮细胞的破坏机制和理解脑血管病的发生以及预防有重大的意义。

Brodsky等[29]首次报道EMPs可减弱乙酰胆碱介导的血管舒张，减少小鼠主动脉NO的释放,增加O2-(超氧阴离子)的产生，且这些效应与EMPs的浓度呈正相关。NO在调节内皮细胞各种功能中起着重要作用，内皮NO合酶作用改变及NO生成减少及超氧化物的产生均导致内皮功能障碍。可能机制为：EMPs通过使一氧化氮合酶解偶联，使其功能从生产NO的酶变为产生超氧化物的NADPH氧化酶， 使NO减少，O2-和H2O2增加[20, 29]。EMPs也已被证明可以通过刺激内皮细胞产生活性氧自由基(ROS)，进一步破坏内皮细胞。

3.2EMPs与动脉粥样硬化 目前认为动脉粥样硬化的形成是由于血管内皮功能障碍和炎症反应相互作用引起的一个动态的、进展的病理过程，是血管炎症后损伤的一种表现[30]。EMPs可导致血管内皮细胞发生功能紊乱而分泌多种炎症因子，同时在其表面表达黏附分子，可结合白细胞和单核细胞等并促进其向内皮细胞的迁移，促进炎症反应。当白细胞进入内皮后会分泌更多的炎症介质，同时摄取氧化低密度脂蛋白，形成泡沫细胞，使病灶逐步发展，以致形成脂纹和纤维斑块，最终导致粥样硬化斑块形成。现有研究报道，从人动脉硬化斑块衍生出的细胞膜微粒还可以通过促使内皮功能失调及内部斑块的促凝活性和新生血管形成，进而促进动脉硬化的形成[31]，由此形成恶性循环，增加粥样硬化的不稳定性，最终导致斑块破裂，发生脑血管事件。

3.3EMPs与急性缺血性脑卒中缺血性脑卒中为脑部血液循环障碍，脑组织缺血、缺氧所导致局限性脑组织缺血坏死或软化、神经功能受损的疾病，包括脑梗死及脑栓塞。EMPs促进缺血性脑卒中发病的可能机制为：内皮细胞膜微粒的表面有大量的磷脂酰丝氨酸，这种阴离子磷脂是最有效的组织因子启动剂，激活因子Ⅶa及凝血级联反应，导致血栓的形成，进而发生缺血性脑卒中事件。

Simak等[32]研究报道，EMPs的数量在急性缺血性脑卒中的患者中，远远高于正常人及有脑血管病高危因素的人群，而且EMPs的数量与脑缺血的程度、面积及患者的临床预后密切相关。随后Keun-Hwa等[4]研究发现，CD62E+EMPs比其他表型的EMPs的数量对急性脑梗死体积及NIHSS评分有着更显著的关联。上文指出内皮细胞激活时释放CD62E+EMP，因此推测，在急性缺血性脑卒中诱导梗死后反应的主要因素来源于内皮细胞的活化而非凋亡[33]，同时表明内皮细胞的活化是一个病理过程，而非修复过程。随后的动物实验研究报道循环内皮细胞膜微粒和内皮祖细胞膜微粒的数量与糖尿病鼠的血糖浓度以及脑梗死面积呈正相关关系[3]，也证明了EMPs与脑梗死面积的关联。以上研究表明，EMPs可能为判断急性缺血性脑卒中患者的脑缺血程度、梗死面积及临床预后的重要血液标记物。

3.4EMPs与颅内外动脉狭窄 Keun-Hwa等[4]研究报道，有脑血管病致病危险因素的患者中，颅外动脉狭窄的患者CD62E+EMPs数量显著升高，而颅内动脉狭窄的患者CD31+/CD42-和CD31+/AV+EMPs数量显著升高。因此，患者血液中的CD62E+EMPs与CD31+/CD42b-EMPs或CD31+/AV-EMPs的比例可用来区分颅外和颅内动脉狭窄。从研究中也可看出，颅外动脉狭窄主要的病理改变为内皮细胞激活，而颅内动脉狭窄主要为内皮细胞凋亡。因此循环中的内皮细胞膜微粒的多种不同的抗原表型在脑血管病中有着不同的生物学意义，可为及时的诊断、临床风险的评估、治疗方式的选择及预后的评估有着重要的指导意义。

3.5EMPs与血管重塑血管结构的改变即血管重塑是高血压病、糖尿病、动脉粥样硬化的重要特征[34-36]。当血管腔横断面积变小及血管壁增厚时，这种重塑被称为向内重塑，其可以用血管壁层和管腔的面积比的增加来反映[34, 37]。 脑动脉血管的向内重塑可能会增加缺血性脑卒中的风险及脑部的缺血性损害。最近的一项研究展示，升高的内皮细胞膜微粒与颈部的向内重塑可能存在正相关的关系[38]。也有研究发现, 人乳脂球表皮生长因子VIII(MFG-E8)可作为动脉壁老化、向内重塑的生物标志物， 而MFG-E8正是内皮细胞膜微粒重要的组成部分。但目前循环细胞膜微粒与大脑动脉血管重塑的潜在机制仍然未明确。可能机制为：一氧化碳合酶(eNOS)在血管中扮演着重要角色，并且可以调节血管的大部分功能[39，40]。未耦合的一氧化氮合酶可以导致内皮功能失调以及高血压或动脉粥样硬化[41]，可使血管内向重塑。

3.6EMPs与治疗 目前有研究表明，将与正常细胞膜微粒共培养的内皮祖细胞注射到缺血性脑卒中的小鼠后，减少了小鼠的缺血性损伤，而这种效益却在与糖尿病小鼠中提取的MPs共培养的EPCs中减少或消失。因为来自于正常小鼠的循环内皮细胞膜微粒可以通过PPARα/NF-kB/Akt路径促进内皮祖细胞的分化以及血管再生[42]。也有研究表明,激活血小板及血小板微粒含有多种至关重要的生长因子和营养因子,并可能成为受损神经修复和血管再生的新的治疗药物。可能机制为：血小板及其微颗粒可以通过刺激内源性干细胞(eNSC)的增殖、迁移和分化促进神经发生,通过从内皮细胞和星形胶质细胞释放的神经源性信号刺激血管生成。表明血小板微粒具有增强血管再生、神经发生和神经保护的作用，可改善中风后的功能障碍[43]。EMPs是否有同样的效益，还有待于将来的研究所证实。因此细胞膜微粒有可能成为治疗脑血管疾病的一个靶点[44]。这为脑血管病的治疗又提出了一个新的方案，但如何应用于临床之中，还有待于进一步的研究。

综上所述，一方面，EMPs可能诱导内皮细胞功能损害，另一方面，也是有内皮细胞损害而形成和释放的产物。一方面，内皮细胞膜微粒可能诱导脑血管疾病，另一方面，也可能是由脑血管疾病应答所产生的。EMPs在内皮功能紊乱、炎症反应、血栓形成及血管生成中起着重要的作用，研究也表明EMPs在脑动脉粥样硬化形成、急性缺血性脑卒中、脑血管狭窄及脑血管重塑中扮演着重要的角色。EMPs可能成为预测脑血管疾病的新的生物学标记物，对脑血管病的预防、治疗及评估预后有着重要的临床意义。同时，生理状态下的EMPs可促进内皮祖细胞的分化，可能成为治疗脑血管病的新的治疗措施。但目前EMPs对脑血管损害的机制还未完全明确，如何将其应用于脑血管疾病的诊疗过程中还有待于今后的进一步研究。

1Mause S F，C Weber.Microparticles: protagonists of a novel communication network for intercellular information exchange[J]. Circ Res, 2010，107(9): 1047

2Martinez M C, S Tual-Chalot, D Leonetti,etal.Microparticles:targets and tools in cardiovascular disease [J]. Trends Pharmacol Sci, 2011，32(11): 659

3Chen J, S Chen, Y Chen,etal.Circulating endothelial progenitor cells and cellular membrane microparticles in db/db diabetic mouse: possible implications in cerebral ischemic damage [J]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2011，301(1): E62

4Jung K H, K Chu, S T Lee,etal.Circulating Endothelial Microparticles as a Marker of Cerebrovascular Disease [J]. Annals of Neurology,2009，66(2): 191

5Jimenez J J, W Jy, L M Mauro,etal.Endothelial cells release phenotypically and quantitatively distinct microparticles in activation and apoptosis [J]. Thromb Res,2003，109(4): 175

6Hamilton K K, R Hattori, C T Esmon,etal.Complement proteins C5b-9 induce vesiculation of the endothelial plasma membrane and expose catalytic surface for assembly of the prothrombinase enzyme complex [J]. J Biol Chem,1990， 265(7)：3809

7Simons M，G Raposo.Exosomes-vesicular carriers for intercellular communication [J]. Curr Opin Cell Biol, 2009，21(4): 575

8Thery C, M Ostrowski, E Segura.Membrane vesicles as conveyors of immune responses [J]. Nature Reviews Immunology, 2009，9(8): 581

9Hristov M, W Erl, S Linder,etal.Apoptotic bodies from endothelial cells enhance the number and initiate the differentiation of human endothelial progenitor cells in vitro [J]. Blood, 2004，104(9): 2761

10Bueno Jimenez C.Circulating microparticles from patients with coronary artery disease cause endothelial dysfunction [J]. Rev Esp Cardiol (Engl Ed), 2012， 65(4): 389

11Parker B, A Zaki, S Haque,etal.Endothelial Microparticles As a Biomarker for Endothelial Dysfunction in Active Systemic Lupus Erythematosus [J]. Arthritis and Rheumatism, 2012，64(s 10): 270

12Tramontano A F, R Lyubarova, J Tsiakos,etal.Circulating endothelial microparticles in diabetes mellitus [J]. Mediators Inflamm, 2010，2010: 250476

13Takahashi T, S Kobayashi, N Fujino,etal.Increased circulating endothelial microparticles in COPD patients: a potential biomarker for COPD exacerbation susceptibility [J]. Thorax, 2012，67(12): 1067

14Xue S, X Cai, W Li,etal.Elevated plasma endothelial microparticles in Alzheimer's disease [J]. Dement Geriatr Cogn Disord, 2012，34(3-4): 174

15Brown M D, D L Feairheller, S Thakkar,etal.Racial differences in tumor necrosis factor-alpha-induced endothelial microparticles and interleukin-6 production [J]. Vasc Health Risk Manag,2011，7: 541

16Devaraj S, P R Kumaresan，I Jialal.C-Reactive Protein Induces Release of Both Endothelial Microparticles and Circulating Endothelial Cells In Vitro and In Vivo: Further Evidence of Endothelial Dysfunction [J]. Clinical Chemistry, 2011，57(12): 1757

17Simoncini S, M S Njock, S Robert,etal.TRAIL/Apo2L mediates the release of procoagulant endothelial microparticles induced by thrombin in vitro: a potential mechanism linking inflammation and coagulation [J]. Circ Res, 2009， 104(8): 943

18Faure V, L Dou, F Sabatier,etal.Elevation of circulating endothelial microparticles in patients with chronic renal failure [J]. J Thromb Haemost, 2006，4(3):566

19Terrisse A D, N Puech, S Allart,etal.Internalization of microparticles by endothelial cells promotes platelet/endothelial cell interaction under flow [J]. Journal of Thrombosis and Haemostasis,2010，8(12):2810

20Burger D, A C Montezano, N Nishigaki,etal. Endothelial Microparticle Formation by Angiotensin II Is Mediated via Ang II Receptor Type I/NADPH Oxidase/Rho Kinase Pathways Targeted to Lipid Rafts [J]. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology,2011，31(8):1898

21Simak J, K Holada, J G Vostal.Release of annexin V-binding membrane microparticles from cultured human umbilical vein endothelial cells after treatment with camptothecin [J]. BMC Cell Biol,2002，3:11

22Szotowski B，S Antoniak, P Goldin-Lang,etal.Antioxidative treatment inhibits the release of thrombogenic tissue factor from irradiation- and cytokine-induced endothelial cells [J]. Cardiovasc Res, 2007，73(4): 806

23Zwaal R F A, P Comfurius, E M Bevers.Surface exposure of phosphatidylserine in pathological cells [J]. Cellular and Molecular Life Sciences, 2005，62(9): 971

24Sebbagh M, C Renvoize, J Hamelin,etal.Caspase-3-mediated cleavage of ROCK I induces MLC phosphorylation and apoptotic membrane blebbing [J]. Nat Cell Biol, 2001，3(4): 346

25Emmert D A, J A Fee, Z M Goeckeler,etal.Rho-kinase-mediated Ca2+-independent contraction in rat embryo fibroblasts [J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2004， 286(1):C8

26Tramontano A F, J O'Leary, A D Black,etal.Statin decreases endothelial microparticle release from human coronary artery endothelial cells: implication for the Rho-kinase pathway [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2004， 320(1):34

27Banff C，Brioschi M, Wait R,etal.Proteome of endothelial cell-derivedprocoagulant mieropartieles[J]．Protcemies，2005，5(17)：4443

28Horstman L L, W Jy, J J Jimenez,etal.New horizons in the analysis of circulating cell-derived microparticles [J]. Keio J Med, 2004,53(4):210

29Brodsky S V, F Zhang, A Nasjletti,etal.Endothelium-derived microparticles impair endothelial function in vitro [J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2004,286(5):H1910

30Montero-Vega M T.The inflammatory process underlying atherosclerosis [J]. Crit Rev Immunol, 2012,32(5):373

31Leroyer A S, P E Rautou, J S Silvestre,etal.CD40 ligand+ microparticles from human atherosclerotic plaques stimulate endothelial proliferation and angiogenesis a potential mechanism for intraplaque neovascularization [J]. J Am Coll Cardiol, 2008,52(16):1302

32Simak J, M P Gelderman, H Yu,etal.Circulating endothelial microparticles in acute ischemic stroke: a link to severity, lesion volume and outcome [J]. J Thromb Haemost,2006,4(6):1296

33Williams J B, E C Jauch, C J Lindsell,etal.Endothelial microparticle levels are similar in acute ischemic stroke and stroke mimics due to activation and not apoptosis/necrosis [J]. Acad Emerg Med, 2007,14(8):685

34Schiffrin E L.Vascular remodeling in hypertension: mechanisms and treatment [J]. Hypertension, 2012,59(2):367

35Endemann D H, Q Pu, C De Ciuceis,etal.Persistent remodeling of resistance arteries in type 2 diabetic patients on antihypertensive treatment [J]. Hypertension, 2004,43(2):399

36Birnbaum Y, M C Fishbein, H Luo,etal.Regional remodeling of atherosclerotic arteries: a major determinant of clinical manifestations of disease [J]. J Am Coll Cardiol, 1997,30(5):1149

37Pires P W, C Deutsch, J L McClain,etal.Tempol,a superoxide dismutase mimetic, prevents cerebral vessel remodeling in hypertensive rats [J]. Microvasc Res, 2010, 80(3):445

38Chironi G N, A Simon, C M Boulanger,etal.Circulating microparticles may influence early carotid artery remodeling [J]. Journal of Hypertension, 2010, 28(4):789

39Sessa W C.Molecular control of blood flow and angiogenesis: role of nitric oxide [J].J Thromb Haemost, 2009, 7(s1): 35

40Huang P L.eNOS, metabolic syndrome and cardiovascular disease [J]. Trends Endocrinol Metab, 2009, 20(6):295

41Toda N, K Ayajiki, T Okamura.Cerebral blood flow regulation by nitric oxide: recent advances [J]. Pharmacol Rev, 2009, 61(1):62

42Benameur T, S Tual-Chalot, R Andriantsitohaina,etal.Pparalpha Is Essential for Microparticle-Induced Differentiation of Bone Marrow-Derived Endothelial Progenitor Cells and Angiogenesis [J]. Hypertension, 2009, 54(5):1169

43Hayon Y, E Shai, D Varon,etal.The Role of Platelets and their Microparticles in Rehabilitation of Ischemic Brain Tissue [J]. Cns & Neurological Disorders-Drug Targets, 2012, 11(7):921

44Tual-Chalot S, C Guibert, B Muller,etal.Circulating Microparticles from Pulmonary Hypertensive Rats Induce Endothelial Dysfunction [J]. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, 2010, 182(2):261