反胶束萃取阿魏酸酯酶

王镇发，陈培钦，邓秩韬，谢晨，李夏兰

（华侨大学 化工学院，福建 厦门361021）

阿魏酸酯酶（EC 3.1.1.73）是羧酸酯水解酶的一个亚类，属胞外酶，其主要生物功能是水解多糖与阿魏酸连结的酯键［1］.1987年，Mackenzie等［2］首次在橄榄色链霉菌中发现了阿魏酸酯酶；1991年，Faulds等［3］成功分离纯化了阿魏酸酯酶.到目前，已从真菌和细菌中得到超过40种阿魏酸酯酶［4-6］，各种微生物分泌的阿魏酸酯酶在氨基酸序列、肽链的结构、物化性质和催化特性上有所不同［4-7］.阿魏酸酯酶的分离纯化是其应用的基础，所以阿魏酸酯酶的分离纯化一直都是研究的一个重点.相比于层析法，反胶束萃取蛋白质具有成本低、回收率高、操作时间短和处理量大等优点.本实验室已从腐烂的木质纤维中筛选到1株产阿魏酸酯酶的菌株，并对其进行了鉴定［8］.本文研究反胶束萃取法分离纯化该菌种发酵所产的阿魏酸酯酶，为阿魏酸酯酶的应用提供前期的基础.

1 实验材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

反式阿魏酸标准品，美国Sigma公司；阿魏酸甲酯，华侨大学化工学院曾庆友老师合成；十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），分析纯，北京佰利申科贸有限公司；异辛烷，正己醇，甲醇，氯化钾等均为市售，分析纯.

DYY-8C型电泳仪，北京市六一仪器厂；Agilent 1100型高效液相色谱仪，美国Agilent公司；Thermo EC120小型垂直电泳系统，美国Thermo公司；ODS-C18型色谱柱（5μm，4.6 mm×250 mm），美国Thermo公司；MW3500型透析袋，上海绿鸟科技发展有限公司；XW-80A型漩涡混合仪，上海精科实业有限公司.

1.2 实验方法

1.2.1 发酵液的制备 菌种及发酵液的制备，参见文献［9］.

1.2.2 阿魏酸及阿魏酸酯酶酶活的测定 阿魏酸的测定采用HPLC法［8］.阿魏酸酯酶活测定方法参见文献［9］.

1.2.3 蛋白质浓度测定 蛋白质浓度的测定采用考马斯亮蓝法［10］.

1.2.4 反胶束萃取阿魏酸酯酶 1）萃取.用1 mol·L-1HCl溶液、1 mol·L-1NaOH溶液调节酶液p H值，用KCl调节酶液的离子强度.称取一定质量的CTAB加入小试管中，再加入2 m L体积比为1：5的正己醇／异辛烷溶液，振荡片刻，加入等体积的酶液，漩涡振荡2 min，室温静置；待分层后测定下层水相的酶活力和蛋白浓度，计算萃取率（E）和纯化倍数（D）.2）反萃取.在另一只小试管中加入1.5 m L萃取相，再加入等体积一定p H值和浓度的KCl溶液，漩涡振荡2 min，室温静置；待油水分层后测定下层水相中的酶活力和蛋白浓度，计算总萃取率（Et）和纯化倍数.

1.2.5 电泳 将经反胶束萃取和反萃取的的酶液进行SDS-PAGE电泳.

2 结果与讨论

2.1 p H值对萃取率的影响

在KCl浓度为0.01 mol·L-1时萃取阿魏酸酯酶，结果如图1所示.从图1可知：萃取液p H值为12时，萃取率最高，达到94.5%.p H值主要决定蛋白质所带的静电荷，进而改变蛋白质表面电荷和反胶束内表面电荷间的静电作用［11］.CTAB是阳离子表面活性剂，极性头带正电.因此，只有在水相p H值大于蛋白质等电点时，蛋白质带负电荷，才能被包裹进反胶束中.该菌分泌的阿魏酸酯酶的pI值还未测定，但据报道，不同菌株来源的阿魏酸酯酶的pI值在3～10之间［12］.所以p H值越大，水相p H值和蛋白质等电点的差值越大，静电作用就越强，萃取率就越高.

2.2 KCl浓度对萃取率的影响

在p H值为12时萃取阿魏酸酯酶，结果如图2所示.从图2可知：随着离子浓度的增高，萃取率迅速降低，KCl浓度为0.5 mol·L-1时，萃取率只有15%.这可用双电子层理论［11］解释，即离子强度的增加减弱了表面活性剂极性头之间的斥力，反胶束体积变小，蛋白质甚至无法进入反胶束.

图1 p H值对萃取率的影响Fig.1 Effect of p H value on extraction efficiency

图2 KCl浓度对萃取率的影响Fig.2 Effect of concentration of KCl on extraction efficiency

2.3 CTAB浓度对萃取率的影响

在p H值为12，KCl浓度为0时萃取阿魏酸酯酶，结果如图3所示.从图3可知：当CTAB浓度小于25 mmol·L-1时，萃取率随着CTAB浓度的增加而提高.这是因为表面活性剂浓度的增加使反胶束的数量增加，萃取率提高.当CTAB浓度达到25 mmol·L-1时，水相中的阿魏酸酯酶全部进入反胶束中，萃取率接近100%.

2.4 反萃取时水相p H值对反萃取的影响

图3 CTAB浓度对萃取率的影响Fig.3 Effect of concentration of CTAB on extraction efficiency

优化条件下（p H值为12，CTAB浓度为25 mmol·L-1，KCl浓度为0）对阿魏酸酯酶进行萃取后，在0和0.15 mol·L-1的KCl溶液中进行反萃取阿魏酸酯酶，结果如图4所示.从图4可知：当KCl浓度为0.15 mol·L-1，p H值为5～10时，其反萃取率为70%左右；而当p H＞8时，反萃取率下降.若KCl浓度为0时，改变水相的p H值，即使当水相p H值低于阿魏酸酯酶的pI值时，阿魏酸酯酶带正电荷与CTAB的极性头所带的正电荷排斥，也无法实现阿魏酸酯酶从反胶束中的反萃取.这说明在萃取中起作用的不只是静电作用，还有其他的因素，如疏水相互作用［11］、立体相互作用和特异性相互作用［12］.

2.5 反萃取时水相的KCl浓度对反萃取的影响

用p H值为7的不同浓度KCl溶液进行反萃取阿魏酸酯酶，结果如图5所示.从图5可知：随着KCl浓度的升高，反萃取率逐渐增大，当KCl浓度为0.20 mol·L-1时，反萃取率最高为79%.当离子强度增大时，反胶束表面双电层变薄［13］，阿魏酸酯酶与反胶束表面之间的静电吸引减弱，酶在反胶束中的溶解度降低，从而使反萃取率提高.但进一步提高KCl浓度，反萃取率开始下降，当KCl浓度为0.25 mol·L-1时，萃取率仅为56%.这可能是较高的KCl浓度会导致酶的盐析，从而使反萃取率降低.

图4 反萃取水相的p H值对总萃取率的影响Fig.4 Effect of p H in backward aqueous phase on the total extraction efficiency

图5 反萃取水相KCl浓度对总萃取率的影响Fig.5 Effect of concentration of KCl in backward aqueous phase on the total extraction efficiency

透析后粗酶液在p H值为12，CTAB浓度为25 mmol·m L-1，KCl浓度为0下萃取，在0.2 mol·L-1KCl下反萃取，酶活力（z）和蛋白浓度（c（蛋白质））的变化如表1所示.通过萃取和反萃取，阿魏酸酯酶回收率（Et）为79.0%，比活（Δz）从51.7μkat·g-1提高到356.7μkat·g-1，纯化倍数（D）为6.9.

表1 阿魏酸酯酶纯化的各参数Tab.1 Summary of the purification of feruloyl esterases

2.6 反胶束纯化结果电泳

图6为不同透析时间的阿魏酸酯酶液反胶束萃取纯化后的SDS-PAGE电泳图.其中：1为Marker；2为发酵液；3为经反胶束萃取及反萃取的纯化结果.从图6中可知：在条带35 ku左右有一条带，与本实验室报导的相近［9］，为阿魏酸酯酶的条带.同时还可以看出：CTAB反胶束纯化阿魏酸酯酶有较好的效果，尤其是对除去分子量大于阿魏酸酯酶的蛋白质.

3 结论

图6 阿魏酸酯酶液反胶束萃取后的电泳图Fig.6 Electrophoresis of feruloyl esterase after reverse micelles extraction

研究结果表明：萃取时，透析后的粗酶液的p H值为12时，与等体积的25 mmol·L-1CTAB反胶束溶液混合，阿魏酸酯酶萃取率最高，接近100%；反萃取时，将反胶束与等体积p H值为7的0.20 mol·L-1KCl溶液混合，漩涡振荡3 min，阿魏酸酯酶总得率最高为79%，比活从粗酶液的51.7μkat·g-1提高到356.7μkat·g-1，纯化倍数为6.9.阿魏酸酯酶酶液经反胶束萃取后，SDS-PAGE电泳只显示两条带，说明CTAB／正己醇／异辛烷反胶束体系能有效地分离纯化阿魏酸酯酶.此方法与层析法相比，具有提取时间短、成本低、易于放大等优点.

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