不同养地方式下烤烟根系差异蛋白质组学分析

尤垂淮，唐莉娜，陈冬梅，陈顺辉 ，黄锦文，周阳，张重义，林文雄

1福建农林大学农业生态研究所, 福州 350002;

2 福建农林大学烟草研究所, 福州 350002；

3 福建省烟草专卖局烟草农业科学研究所, 福州 350003

生物的生长发育是基因的表达过程，蛋白质是基因的表达产物，在蛋白质组学水平上揭示生命现象的本质和活动规律，是现代分子生物学研究的热点[1]。蛋白质组是蛋白质组学的研究对象，从整体蛋白质水平上，从贴近生命本质的层次上去发现和探索生命活动的规律和重要的生理、病理现象等。烟草在生长过程中，面临很多病害的危害，如烟草根黑腐、根结线虫病、烟草黑胫病、烟草青枯病、黄瓜花叶病等侵染性病害，这些病害均与烟草的根系紧密相关，影响了烟草对土壤养分的吸收，使烟草产量变低，品质下降，造成大量的经济损失，阻碍了烟草产业的进一步发展。植物蛋白质组水平因外界环境条件改变而产生变化，通过蛋白质组学，探讨植物逆境下生理代谢变化，获得蛋白质与抗性之间的关系，有助于植物抗逆性的研究，并已在植物研究中取得了一定的成果[2]，本文的研究材料主要从根系差异蛋白着手，探讨合理的以烟为主的的耕作制度，为攻克以上烟草各种根系病害提供理论基础与技术支撑。

迄今，有关烟草根系在蛋白质组学水平上的研究，在国内外还很少报道，特别是南方耕作制度下，探讨烟草根系差异蛋白质组学甚少。本研究主要采用不同的养地方式，通过蛋白质组学手段，旨在蛋白质组学水平上揭示不同养地方式下烤烟根系生长情况，为寻求更加适合福建清香型烟叶生长的耕作措施提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2007～2010年在南平浦城县仙阳烤烟试验站基地进行，供试烤烟品种为K326。试验田地势平坦，土壤质地为砂壤土。试验田种植情况为：从2007年起，上半年（2007年3月～7月）种烟草，下半年（2007年7月～11月）种水稻。

1.2 试验设计

试验设三种养地方式，前处理均一致，即从2007年起，上半年（2007年3月-7月）种烟草，下半年（7月-11月）种水稻。而后采用不同养地方式（2007年11月-2008年3月）：WF为对照，冬闲；RS：稻草回田；AS：冬种紫云英，紫云英回田。试验采用随机区组设计，每个处理设3次重复，共计9个小区。每个处理小区种5畦，每畦植烟44株，共220株，行株距1.2m×0.5m。田间管理都按规范化栽培措施进行。2008年3月、2009年3月采用以上相同的养地方式连续两次实行田间定位试验，在田间定位第4年即2010年，取样进行室内实验。

1.3 取样方法

本试验采取田间定位试验，即在2010年，烤烟旺长后期时，挖取根系，用水洗净后，甩干，用剪刀剪相同部位根系，用锡箔纸包住，迅速置于液氮中，之后一并保存到-80℃冰箱，备用。

1.4 试剂与仪器

丙烯酰胺（acrylamide, Acr）、N, N-甲叉丙烯酰胺（N,N-methylenebisacrylamide, Bis-Acr）、三羟甲基氨基甲烷(Tris aminomethane, Tris-base)、尿素(Urea)、十二烷基磺酸钠(Sodium Dodecyl sulfate,SDS)、N,N,N',N'-四甲基二乙胺 (N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine, TEMED)、甘氨酸(Glycine)均为Sigma公司产品；载体两性电解质Ampholine(pH 3-10, pH 5-8)为GE Healthcare公司产品；硫脲(Thiourea)、3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸(CHAPS)、壬基酚聚氧乙烯醚(NP- 40)、二硫苏糖醇(dithiothreitol, DTT)、过硫酸铵(Ammonium persulfate, AP)、Tris平衡酚pH 8.0均为Solarbio公司产品；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、三氯乙酸(TCA)、甘油(Glycerol)、磷酸、氢氧化钠、无水乙醇、甲醇、无水乙酸钠、无水碳酸钠、硫代硫酸钠、硝酸银、冰乙酸、甲醛溶液等药品及有机溶剂均为国药集团化学试剂公司产品。以上所有药品、试剂都为分析纯，所有溶液均用Milli-Q超纯水配制。

主要仪器：高速冷冻离心机为德国Eppendorf公司产品；真空干燥机出自上海新苗医疗器械制造有限公司；紫外-可见分光光度计为美国VARIAN公司产品；Protean IEF等电聚焦系统、SDS-PAGE垂直电泳均产自美国Bio-Rad公司；凝胶成像系统imagescan为瑞典GE Healthcare公司产品。

1.5 根系蛋白质样品的制备

称取5g根系，加入少许的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，在液氮冷冻条件下研磨至粉末，采用Mg-NP40法：参照Lee等[3]的方法并有所改进，加入10 mL提取缓冲液（0.5mol/l Tris缓冲液pH8.3,2%V/V NP-40，20 mmol/L MgCl2，2%V/V B-巯基乙醇，1 mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）），置冰上摇床振荡5～10 min，置冰上超声30 min。4℃，10000 rpm，离心30 min，取上清。加入3倍体积10% TCA（10%TCA，0.07% B-巯基乙醇，丙酮），置于-20℃冰箱过夜。多洗几次，期间用80%丙酮（含0.07% B-巯基乙醇）洗1次，直至上清液澄清。最后4℃，11000 rpm，离心25 min，弃上清，低温真空干燥，制成蛋白质干粉，置于-80℃冰箱。

1.6 蛋白质的裂解与浓度测定

1.6.1 蛋白质的裂解

Mg-NP40法提取的根系蛋白质与裂解液的比例为1mg:10μL。裂解液的配方：42%尿素，2 mol/L Thiourea，65 mmol/L DTT，4% CHAPS，0.2%两性电解质（3.5-10）。

1.6.2 蛋白质浓度的测定

根据Bradford[4]方法，用牛血清白蛋白制作标准曲线，蛋白浓度为0-90 μg/μL，在λ=595 nm时，应用紫外-可见分光光度计测定蛋白质浓度。

1.7 双向电泳

第一向等电聚焦电泳（IEF）和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳参照Lee[3]、王经源[5]、吴林坤[6]等的方法，略有改进下进行的。

1.8 胶体染色与图像的扫描分析

电泳结束后，采用硝酸银染色方法染色[7]。胶片使用imagescan(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)扫描，并用软件ImageMasterTM 2D Platinum 5.0(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)进行图像分析。

1.9 蛋白质点胶内酶解及肽段提取

1.9.1 脱银

向取下的蛋白点加60 μL DD.H2O洗2-3次，10 min/次；加60 uL 100%乙腈，用漩涡振荡器振荡5 min，重复3次，脱水至胶粒完全变白，超净台吹干20～ 30 min。

1.9.2 胶内消化

加入新鲜配制的10 mmol/L DTT（在990 μL 25 mmol/L NH4HCO3加入10 μL 1 mol/L DTT 配制）20 μL溶液，57℃孵育1 h；冷却至室温，用枪头吸去残留液。加入20 μL 55 mmol/L碘乙酰胺（55 μL 1 mol/L IAM，945 μL 25 mmol/L NH4HCO3现配）20 μL溶液，置于暗室 60 min。吸弃上清，用100 μL的移液器加入60 μL 100 mmol/L NH4HCO3溶液，用漩涡震荡器震荡混匀，室温静置5 min，如此重复1-3次；用移液器吸弃上清，加入60 μL乙腈，漩涡震荡器震荡混匀，室温静置5 min，重复1次；吸弃上清，加入60 μL 100 mmol/L NH4HCO3溶液，漩涡震荡器震荡混匀，室温静置5 min；接着弃上清，加入60 μL乙腈，漩涡震荡器震荡混匀，室温静置5 min，重复1次，超净台吹干，30 min。加入15μL消化液（12.5 ng/μL胰酶（50 mmol/L NH4HCO3配制）溶液），混匀，4℃或冰上放置30 min；用移液枪吸出多余的液体，接着加入10 μL 50mmol/L碳酸氢铵溶液，转速6000 rpm离心30 s，37℃消化12 h。

2 质谱分析

2.1 上样

将其冷却至室温，转速6000 rpm离心5 min，用移液枪收集消化液于一新1.5 mL离心管中；用20 mmol/L碳酸氢铵溶液补至溶液终体积为15-20 μL；将其转移至上样管；用于质谱分析。

2.2 LC MS/MS分析

LC MS/MS分析是在福建农林大学农业生态研究所进行的。LC条件：高效液相色谱仪：Thermo Scientif i c Surveyor System；色谱柱：BioBasic C18 Column (100 x 0.18 mm，particle size: 5 um)；样品量：10 μL；流动相：A: 0.1%Formic acid in water；B: 0.1% Formic acid in acetonitrile；梯度：5% -35% B in 20 minutes, 35%-95% B in 2 minutes；流速：2.5 μL/min；MS条件：质谱仪：LTQ-XL (Thermo Scientif i c)；喷雾电压：3.5 kV；毛细管温度：275 ℃；鞘气流速：15 arb；母离子扫描范围：400-2000 m/z；Isolation width：2 Da。二级质谱条件：AGC Target 1e4, 1 microscans；碰撞能量：35% CID。

2.3 数据库查询及蛋白质鉴定

质谱分析所获得的原始数据用Proteome Discoverer1.2软件进行相对定量分析及数据库的检索。搜索使用的数据库为从NCBI下载的物种名称的物种名称（英文）.fasta蛋白库。

3 结果

3.1 不同养地方式处理烤烟根系差异蛋白质图谱构建

蛋白质双向凝胶电泳图谱，如图1，在等电点从3.5到10和分子量为14 KD到116 KD的范围中，通过软件ImageMaster5.0的分析，去除假点，每块胶大概有430个点左右。图谱清晰，蛋白质点圆，蛋白质点之间分离很好。

3.2 差异蛋白质点的LC MS/MS分析与鉴定

当对应两个蛋白点之间差异达到1.5倍以上，认为表达量有显著差异，在根系样品中检测到39差异点，对这39个差异蛋白质点进行LC MS/MS分析和生物信息学查询后得到24个蛋白质点的质谱结果，22已知蛋白，2个未知蛋白，鉴定到的蛋白见表1。

通过数据库查找，根据蛋白的功能可以将鉴定到的22个蛋白分成六大类：

3.2.1 与植物光合和营养代谢相关蛋白

与植物光合作用相关蛋白1个，转酮醇酶（spot2:transketolase）；与营养相关蛋白1个，GDP-甘露糖-3',5'-表异构酶（spot13:GDP-mannose 3',5'-epimerase, GME）。

3.2.2 与能量代谢相关蛋白

与能量相关蛋白有6个，NADP-依赖性的苹果酸脱氢酶（spot4:NADP dependent malic enzyme) ,AAA型腺苷三磷酸酶属蛋白（spot24:AAA-type ATPase family protein），液泡ATP合成酶催化亚基A（spot37:vacuolar ATP synthase catalytic subunit A），乙酰辅酶A合成酶（spot23:Acetyl-CoA synthetase，ACS），ATP酶（spot33:ATPase splayed），β-糖苷酶（spot5: beta-glycosidase-like）。

3.2.3 与物质运输以及信号转导相关的蛋白

与信号转导相关蛋白有4个，激酶结合性蛋白磷 酸 酶（spot12:kinase-associated protein phosphatase，KAPP），假定的转座子蛋白（spot36:transposon protein,putative），富亮氨酸重复蛋白激酶（spot39:leucine-rich repeat protein kinase-like protein,LRR-RLK），促分裂原活化蛋白激酶（spot26:Mitogen-activated protein kinase kinase，MAPK）。与物质运输相关的蛋白有2个，Rab3 GTP激活蛋白催化亚基（spot10:Rab3 GTPaseactivating protein catalytic subunit），细胞内囊泡运输蛋白Sly1（spot35:Vesicle traff i cking protein Sly1）。

3.2.4 与核酸代谢相关蛋白

与核酸代谢相关蛋白有3个，核糖体小亚基蛋白4（spot20：ribosomal protein small subunit 4），RNA聚合酶Ⅱ转录延伸因子（spot30:RNA polymerase II transcription elongation factor SPT5），类成熟酶蛋白（spot31:maturase-like protein）。

3.2.5 与蛋白质代谢相关蛋白

天冬氨酸蛋白酶家族蛋白（spot14:Aspartyl protease family protein），E3泛素蛋白连接酶BAH1（spot18:E3 ubiquitin-protein ligase BAH1），水解酶包含域蛋白（spot7:alpha/beta- hydrolase domain-containing protein）。

3.2.6 与植物抗逆相关的蛋白

防御蛋白RGA2（spot21:resistance protein RGA2），线粒体内膜移位酶亚基Tim13（spot25：Tim13/mitochondrial import inner membrane translocase subunit Tim13）。

图1 不同养地方式烤烟根系蛋白图谱

表1 不同养地方式下烤烟根系差异蛋白LC MS/MS质谱分析结果

（续表1）

4 讨论

差异蛋白质组学应用于植物或作物科学相关的分子机制研究日益增多，且从分子水平较好地解释了植物自身遗传表达或对环境响应的分子机理[8]。本研究运用差异蛋白质组学技术在蛋白质水平上初步探讨不同养地方式下烟草根系的蛋白表达谱的变化。

4.1 香气形成

通过在冬季进行不同的处理，分别是冬闲，稻草回田，紫云英回田三种养地方式，根系差异蛋白质结果鉴定到了两个与香气有关的蛋白，转酮醇酶（spot2:transketolase）和GDP-甘露糖-3',5'-表异构酶（spot13:GDP-mannose 3',5'-epimerase, GME）。转酮醇酶是在戊糖磷酸循环以及光合成的还原型戊糖磷酸循环中起着重要作用的酶，在植物光合作用的卡尔文循环中起着核心作用，它的活性是植物最大光合速率的限制因子，其活性的微小下降即可导致植物生长速度下降、芳香族氨基酸和苯丙氨酸代谢产物的抑制[9]。芳香族氨基酸是烟草香气的主要物质，苯丙氨酸代谢途径是影响烟草香味的主要次生代谢途径。GDP-甘露糖-3',5'-表异构酶可以催化GDP-甘露糖转化为左旋GDP-半乳糖，该反应对于高等植物体内抗坏血酸的合成是非常重要的[10]。多酚是烟草中的一类重要物质，在烟草的颜色、香气、吸味和烟气安全性方面都有重要影响，而抗坏血酸能够增强多酚类化合物稳定性，抑制其氧化的作用。这两个酶在稻草回田的养地方式中均上调表达，而在紫云英回田处理上却下调表达，在一定程度上说明稻草回田的烤烟品质较好，冬闲的次之，紫云英回田的最差，主要原因可能是在施肥处于相同水平下，紫云英回田处理下田间氮肥较多，不利于烟叶成熟，最后可能影响品质。

4.2 信号转导

这三种养地方式下，鉴定到4个与信号转导相关的蛋白，激酶结合性蛋白磷酸酶（spot12:kinaseassociated protein phosphatase,KAPP），假定的转座子蛋白（spot36:transposon protein, putative, Mutator subclass），富亮氨酸重复蛋白激酶（spot39:leucine-rich repeat protein kinase-like protein,LRR-RLK）， 促 分裂原活化蛋白激酶（spot26:Mitogen-activated protein kinase kinase,MAPK）。激酶结合性蛋白磷酸酶属于信号蛋白，拟南芥的KAPP可以通过其自身的FHA域对类受体蛋白激酶信号路径进行负调控，这在植物的发育中尤为重要[11]。富亮氨酸重复蛋白激酶，参与植物激素信号转导[12]。促分裂原活化蛋白激酶(MAPK) 是生物体内信号转导途径MAPK 级联反应的重要组分，通过传递胞内外信号，介导生物及非生物胁迫反应、激素反应、调控细胞分化育过程[13]，在ABA 的信号转导途径中MAPK发挥了重要作用。这些酶的上调，促进烟草的生长发育，前面三个酶在稻草回田下是上调表达，而促分裂原活化蛋白激酶在紫云英上是上调表，在冬闲上，这四个酶均下调表达。

4.3 物质运输

与物质运输相关的蛋白有2个，Rab3 GTP激活蛋白催化亚基（spot10:Rab3 GTPase-activating protein catalytic subunit），细胞内囊泡运输蛋白Sly1（spot35:Vesicle trafficking protein Sly1 (Sec1 family)(ISS)），这两个蛋白均在细胞囊泡起作用，前者是细胞囊泡转运途径的关键调节因子，同时参与细胞信号转导，后者在细胞内囊泡参与内质网和高尔基体之间的运输，两者在紫云英上均上调表达，细胞内囊泡运输蛋白Sly1在稻草回田处理也是上调表达，促进代谢顺利进行，促进烟草的生长。

4.4 代谢相关蛋白

与蛋白质代谢相关蛋白3个，天冬氨酸蛋白酶家族蛋白（spot14:Aspartyl protease family protein），E3泛素蛋白连接酶BAH1（spot18:E3 ubiquitin-protein ligase BAH1），水解酶包含域蛋白（spot7:alpha/betahydrolase domain-containing protein）。植物天冬氨酸蛋白酶主要参与植物蛋白的加工、降解过程，在植物衰老、胁迫应激反应、程序性细胞死亡和细胞繁殖等方面起作用[14]。蛋白质的泛素化作为真核生物蛋白质降解的重要机制对许多重要的生物进程如细胞周期、基因转录和细胞信号转导等是至关重要的，E3泛素连接酶负责确定蛋白质泛素化的特异性，识别靶蛋白底物，并在引发26S的蛋白酶体降解蛋白质的过程中起极其重要的作用[15-16]。天冬氨酸蛋白酶家族蛋白和E3泛素蛋白连接酶BAH1在稻草回田上调表达，E3泛素蛋白连接酶BAH1和水解酶包含域蛋白在紫云英上是上调表达，在一定程度上均维持了烟叶的正常生长，而在冬闲上这三个酶均下调表达，冬闲下生长较弱。

5 结论

稻草回田处理下，鉴定到烤烟根系转酮醇酶、GDP-甘露糖-3',5'-表异构酶、乙酰辅酶A合成酶、β-糖苷酶、激酶结合性蛋白磷酸酶（KAPP），假定的转座子蛋白，富亮氨酸重复蛋白激酶、细胞内囊泡运输蛋白Sly1、天冬氨酸蛋白酶家族蛋白，E3泛素蛋白连接酶BAH1、线粒体内膜移位酶亚基Tim13等蛋白，涉及烟草香气的形成、能量转化、信号转导、物质运输、代谢等多种途径，在稻草回田下均上调表达，有此可以看出稻草回田处理为烟草的生长提供了相对稳定的环境，促进根系生长，进而促进烟草生长，有助于提高烟草的产量和品质，提高经济效益，为福建清香型烟叶的发展提供了较佳的耕作措施。在施肥处于相同水平下，紫云英回田处理下田间氮肥较多，与生长相关的蛋白大部分上调表达，烟草生长旺盛，鉴定到涉及烟草香气形成相关的转酮醇酶、GDP-甘露糖-3',5'-表异构酶下调表达，而此时烟草正处于旺长后期即成熟初期，结合大田长势，健壮浓绿，不利于烟叶后期落黄成熟，进而影响烤烟品质。对于紫云英处理，在控制相同氮肥水平即减少紫云英回田的量或者减少氮肥的施用，有待后续实验进一步探讨。

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