碲化镉量子点对大鼠骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化潜能的影响

周煜博，郭 丽，孟春阳，李 鹏，卢日峰，杨小玉，尹 飞

（1.吉林大学公共卫生学院毒理学教研室，吉林 长春 130021；2.吉林大学中日联谊医院骨科，吉林 长春 130033；3.吉林大学第一医院脊柱外科，吉林 长春 130021）

量子点（quantum dots，QDs）是一种纳米材料，具有独特的荧光特性，其吸收光谱较宽，发射光谱较窄，对荧光淬灭效应有一定抗性。碲化镉QDs（CdTe QDs）与传统的有机染料分子比较，具有多种优势，可以作为活细胞标记物［1］，但其应用的前提是不能影响细胞正常生理代谢。已有研究［2－3］表明：在一定浓度范围内，QDs不会引起细胞形态和增殖改变；但大部分研究均以肿瘤细胞系为基础，基于哺乳动物原代细胞培养的研究还少有报道。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）具有多向分化潜能，静脉移植后能定位在受损的组织和器官，标记后追踪其体内的迁移并探讨其作用机制一直是近年来研究的热点［4－5］。但是BMSCs活体标记的前提是标记后其增殖和分化均不受到影响，目前有关CdTe QDs标记BMSCs后对干细胞分化影响的研究较少。因此，本研究拟探讨不同浓度CdTe QDs对BMSCs增殖与成骨分化的影响，为CdTe QDs作为活细胞标记物奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物和主要试剂 新生5d龄Wistar大鼠购于吉林大学动物实验中心，动物合格证号：SCXK－（吉）2008－0005。DMEM／F－12培养基购于Gibco公司，胎牛血清购于Hyclone公司，QDs由吉林大学化学学院提供，发射波长546nm（绿色），粒径2.3nm，乙二醇包被。

1.2 CdTe QDs在培养液中的分散度检测 将CdTe QDs分别加入培养液和蒸馏水中，终浓度1×10－6mol·L－1，分别检测培养液、CdTe QDs水溶液和培养液溶液的荧光光谱，根据光谱峰值的位置推测CdTe QDs在培养液中的分散情况。

1.3 大鼠BMSCs原代培养 新生5d龄Wistar大鼠，断头处死后取肱骨与股骨，剔除肌肉，暴露骨髓腔，用DMEM／F－12培养液将骨髓冲出，制成单细胞悬液。将单细胞悬液以1×106mL－1的密度接种，15%胎牛血清。3d后换半液，7d后待细胞90%融合时传代。

1.4 MTT法检测CdTe QDs对细胞增殖的影响将生长旺盛的第3代BMSCs以5×103个／孔的密度接种于96孔板中，培养24h，待其细胞长满。用倍比稀释的方法将CdTe QDs溶于DMEM／F－12培养液中，浓度依次为0、0.1953、0.3906、0.7813、1.5625、3.1250、6.2500、12.5000、25.0000和50.0000nmol·L－1。吸去孔板内培养液，加入含有不同浓度CdTe QDs的DMEM／F－12培养液，分别培养24、48和72h后，加入5g·L－1的MTT溶液，每孔20μL，培养4h后吸去孔内液体，加入DMSO，每孔150μL，用酶标仪测定490nm波长处吸光度（A）值。计算每个浓度下的细胞增殖率，细胞增殖率（%）＝（暴露组A值－空白组A值）／（对照组A值－空白组A值）×100%。根据MTT测定的细胞增殖率结果绘制散点图，横坐标做对数转换，然后进行对数线性回归，根据回归方程计算半数增殖抑制浓度（IP50）。

1.5 CdTe QDs对BMSCs向成骨细胞分化的影响将生长旺盛的第3代BMSCs接种在铺有多聚赖氨酸（PLL）包被的盖玻片的24孔板中，分别以0.0122、0.0244、0.0488、0.0976和0.1953nmol·L－1CdTe QDs作用48h后，更换成含有地塞米松0.1μmol·L－1、β甘油磷酸钠10mmol·L－1和50mg·L－1维生素C的DMEM／F－12培养液中，诱导14d，取出盖玻片，95%预冷乙醇在－20℃固定细胞15min。

1.6 茜素红染色显示钙结节 PBS冲洗盖片3次，0.1%茜素红染色，室温孵育15min，PBS冲洗后50%甘油封片，显微镜下观察钙结节并计数。根据钙结节形成抑制率结果绘制散点图，横坐标做对数转换，然后进行对数线性回归，根据回归方程计算半数分化抑制浓度（ID50）。

1.7 统计学分析 采用Excel软件图标工具中线性回归模块作为数学计算工具。各组BMSCs的A值和增殖率以表示，组间比较采用方差分析，各组钙结节数量组间比较采用方差分析，采用F检验对回归方程进行显著性检验。

2 结 果

2.1 CdTe QDs在培养液中的分散度 光谱检测结果显示：在蒸馏水中，CdTe QDs的发射波长峰值约为540nm，DMEM／F－12培养液分别在450和520nm处有2个峰值，CdTe QDs的DMEM／F－12溶液也有2个峰值，主峰处在的波长约为520nm，可认为是其与培养液的融合峰，峰高和半峰宽未发生明显改变，主峰未发生红移，说明其在DMEM／F－12中荧光特性保持完好，分散良好，未发生聚合。见图1。

2.2 CdTe QDs作用下BMSCs增殖的变化MTT预实验结果表明：CdTe QDs对BMSCs的浓度－效应曲线呈对数线性关系，符合公式Y＝A·Ln（X）＋B。其中Y为细胞增殖率，X为浓度，A和B均为常数。分别对反映细胞增殖的MTT结果和反映细胞成骨分化的钙结节计数结果进行线性回归，算出回归系数，用F检验对回归方程进行显著性检验。再根据回归曲线算出IP50和ID50。根据Flint采用的方法原理［6］，分别求出IP50和ID50，增殖分化抑制比（IP50／ID50）可作为评判化合物体外毒性指标。

图1 荧光光谱法检测CdTe QDs在不同溶液中的分散度Fig.1 Dispersity of CdTe QDs in different solutions detected with photoluminescence emission spectra

各暴露组的A值与对照组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05），见表1。说明在本实验的浓度范围内，CdTe QDs对BMSCs的增殖具有明显抑制作用。随着CdTe QDs暴露时间延长，其细胞的生长逐渐减少，IP50随着暴露时间延长急剧下降。经计算，CdTe QDs暴露24、48和72h的回归系数分别为－23.96、－29.61和－24.30，经F检验，回归方程差异有统计学意义（P＜0.05），3个时间点的IP50分别为7.25、1.63和0.67nmol·L－1，见表2和图2。

表1 不同浓度CdTe QDs作用不同时间后BMSCs的增殖情况Tab.1 The proliferation of BMSCs after treated with different concentrations of CdTe QDs for different time（）

表1 不同浓度CdTe QDs作用不同时间后BMSCs的增殖情况Tab.1 The proliferation of BMSCs after treated with different concentrations of CdTe QDs for different time（）

＊P＜0.05compared with control group（0nmol·L－1）.

QDs concentration（nmol·L－1）0.1943±0.04150.1965±0.00960.2355±0.04860.19530.1760±0.0185＊0.1633±0.0135＊0.2001±0.0456＊0.39060.1702±0.0162＊0.1383±0.0043＊0.1578±0.0288＊0.78130.1571±0.0230＊0.1268±0.0110＊0.1488±0.0255＊1.56250.1490±0.0107＊0.1215±0.0071＊0.1418±0.0186＊3.12500.1436±0.0157＊0.1230±0.0091＊0.1255±0.0138＊6.25000.1398±0.0076＊0.0995±0.0024＊0.0995±0.0135＊12.50000.1181±0.0039＊0.0768±0.0042＊0.0733±0.0092＊25.00000.1005±0.0089＊0.0620±0.0012＊0.0633±0.0070＊50.00000.0831±0.0046＊0.0556±0.0028＊0.0566±0.00412448720（control）A value（t／h）＊

表2 不同浓度CdTe QDs作用不同时间后BMSCs的增殖率Tab.2 The proliferation rates of BMSCs after treated with different concentrations of CdTe QDs for different time（，η／%）

表2 不同浓度CdTe QDs作用不同时间后BMSCs的增殖率Tab.2 The proliferation rates of BMSCs after treated with different concentrations of CdTe QDs for different time（，η／%）

“－”：No data.

QDs concentration（nmol·L－1）2448720 Proliferation rate（t／h）———0.195387.29±12.8380.57±4.9659.59±4.280.390679.33±8.0161.66±2.7654.00±10.950.781365.30±8.7855.07±6.2647.87±12.361.562568.59±7.4651.61±2.5745.35±7.223.125060.96±5.6952.44±4.9741.64±7.376.250062.24±5.2835.68±1.6027.85±7.1712.500047.22±2.7521.12±2.3213.96±4.8825.000034.98±6.1910.52±0.548.66±3.7650.000022.97±3.206.17±1.525.12±2.19

图2 CdTe QDs对细胞增殖抑制作用的浓度－效应曲线Fig.2 The concentration－effect curve of inhibitory effect of CdTe QDs on proliferation of BMSCs

2.3 不同浓度CdTe QDs对BMSCs分化为成骨细胞的影响 茜素红染色法显示钙结节表明：镜下可见不同大小、不同形态的红色钙化结节，随着CdTe QDs浓度的增加，钙化结节的数量逐渐减少。见图3（封二）。各浓度组的钙结节计数结果与对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3。CdTe QDs对成骨分化的回归系数为－56.15，经F检验，回归方程具有统计学意义（P＜0.05）。见图4。经计算，成骨分化ID50为0.0412nmol·L－1。CdTe QDs暴露48h的IP50／ID50＝39.56。

3 讨 论

本研究中的大鼠BMSCs与其他文献所报道的形态特性一致，首次传代后生长旺盛，2～3d长满瓶底，需要再次传代。倒置显微镜下观察，BMSCs大多呈长梭形，排列紧密。BMSCs是一种具有多向分化潜能的干细胞，能够在增殖的同时保持分化潜能，已有大量研究［7－10］表明：原代培养扩增的BMSCs能够分化成成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞和神经细胞等。因此，干细胞移植已成为治疗各种疑难杂症的希望。但大多数干细胞治疗术仍处于试验阶段，而活细胞标记技术对于干细胞体内移植后的追踪研究非常重要，无毒、高效的活细胞标记物一直以来是人们探索的目标。

表3 不同浓度CdTe QDs作用下BMSCs向成骨细胞的分化Tab.3 The differentiation of BMSCs into osteoblasts after treated with different concentrations of CdTe QDs

图4 CdTe QDs对BMSCs成骨分化抑制作用的浓度－效应曲线Fig.4 The concentration－effect curve of the inhibitory effect of CdTe QDs on BMSCs differentiated into osteoblasts

QDs是一种具有荧光特性的纳米材料，独特的光学特性使其成为理想的活细胞标记物，但其细胞毒性和安全用量一直以来备受学者关注，是目前研究的热点。本研究中，荧光光谱法检测结果表明：CdTe ODs在DMEM／F－12培养液中分散良好，未发生聚合。随着暴露CdTe QDs时间延长细胞的生长逐渐减慢，暴露24、48和72h的IP50分别为7.25、1.63和0.67nmol·L－1。有研究［11－13］报道：CdTe QDs可通过胎盘屏障，穿过完整的表皮结构，在不借助载体的情况下，一定剂量的CdTe QDs可直接穿过细胞膜进入细胞内部。早期研究［14］认为：CdTe QDs的毒性来自于进入细胞内部后电离出的微量Cd2＋，虽然有研究证明QDs状态下的CdTe QDs毒性要比离子状态的Cd2＋毒性更大，但仍缺乏有力证据阐明具体机制。

CdTe QDs作为干细胞的活细胞标记物，不仅对干细胞的形态和数量无影响，而且对于干细胞的分化也不应该产生影响。由于Cd2＋在人体中主要蓄积于骨骼，因此本实验选定成骨细胞作为BMSCs的诱导方向，观察CdTe QDs对成骨细胞分化的影响。本实验结果表明：随着CdTe QDs浓度的增加，BMSCs分化成的成骨细胞逐渐减少。茜素红显示钙结节的方法可以准确有效地反映成骨细胞钙化情况，直接反映间充质干细胞向成骨细胞的分化程度，本实验中，平均每视野钙结节数目随暴露浓度增大而明显减少，浓度－效应关系呈对数线性，说明CdTe QDs抑制成骨分化的效果具有确定性和显著性。此外，IP50／ID50比值为39.56，说明成骨细胞分化率比细胞增殖率更加敏感，同时也说明CdTe QDs影响成骨分化的风险大大高于抑制细胞增殖的风险，因此选择其作为干细胞活体标记物时，标记浓度的选择应重点考虑其对干细胞分化的影响。

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