地塞米松对大鼠脑出血后血肿周围组织IL-8表达的影响

张学敏，马风杰，丁绪平，李 芳，赵玉娇

脑出血（ICH）为原发性非外伤性脑实质内出血，为中老年人的常见病、多发病，其致残率和死亡率均较高，给社会、家庭带来沉重的经济负担。其预后除了与出血量、出血部位有关外，也与血肿周围迟发性脑水肿引起的神经细胞死亡密切相关。近几年研究发现脑出血后血肿周围的炎症反应参与局部水肿的形成［1，2］，因此从血肿周围水肿带形成机制的角度来治疗脑出血备受关注。本研究通过地塞米松对大鼠脑出血血肿周围组织白介素-8（IL-8）表达的影响，探讨地塞米松对脑出血大鼠的神经保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雌性Wister大鼠72只，体重250 g～350 g，购自潍坊医学院实验动物中心。

1.2 仪器与试剂 IL-8抗体（北京博奥森生物技术有限公司），二抗及DAB显色剂（北京中杉金桥生物技术有限公司），地塞米松，10%水合氯醛，75%酒精，双氧水，生理盐水，多聚甲醛，5 m L注射器，立体定位仪（ZH-蓝星 淮北正华设备有限公司）微量注射器，手术器械一套。

1.3 方法

1.3.1 动物分组 将72只大鼠随机分为4组，每组18只，即假手术组、模型组、高剂量组、低剂量组，每组按取脑时间分为12 h、24 h、3 d，每个时间点6只。低剂量组从造模成功后至处死前每天腹腔注射地塞米松（0.5 mg／kg），高剂量组给予地塞米松（1.0 mg／kg），每日1次。模型组、假手术组均于相同时限腹腔注射等容量的生理盐水。

1.3.2 模型制备 采取自体血注入法制备大鼠脑出血模型。术前大鼠禁食12 h，不禁水。10%水合氯醛4 m L／kg腹腔麻醉，检查睫毛反射减弱、捏耳无反应时，将大鼠头部固定立体定向仪，局部备皮，75%乙醇消毒局部皮肤，行顶部正中切口，以双氧水腐蚀局部骨膜，暴露前囟，以前囟中央为中心原点，在原点后1.8 mm、右侧4 mm，用5 m L注射器针头钻孔，用微量注射器插入颅骨表面下5 mm内囊处缓慢注入50μL自体血（断尾取血），留针5 min后缓慢将针退出，然后消毒局部加入青霉素粉并缝合皮肤，回笼饲养模型制备完毕。模型组术后立即给予注射生理盐水1.0 mL。高、低剂量组分别给予1.0 mg／kg、0.5 mg／kg地塞米松。

1.3.3 模型制备成功的标准 大鼠清醒后，无神经功能缺失、意识丧失、死亡的大鼠剔除，据Berderson等的评分标准分为三级。Ⅰ级：将大鼠尾巴提起来，瘫痪侧前肢回收后屈曲于腹下，正常侧前肢向地面伸展；Ⅱ级：除以上体征外，向瘫痪侧推大鼠时阻力较对侧明显降低；Ⅲ级：除以上症状外，大鼠有向患侧侧旋的行为。出现以上症状为造模成功。

1.3.4 标本收集与检测 大鼠在出血后的各个时间点以10%水合氯醛腹腔麻醉，开胸暴露心脏，在心尖部剪开一约2 mm小口，将穿刺针自切口插入心脏并送至主动脉口处固定，37℃生理盐水200 mL灌洗；然后以40 g／L多聚甲醛溶液500 m L灌注内固定后断头取脑，将标本置40 g／L多聚甲醛溶液中后固定约24 h，取血肿周围脑组织，常规石蜡包埋，切片，制片后进行HE染色观察血肿周围组织的炎症反应情况；免疫组化染色观察IL-8的表达，IL-8免疫组化阳性表达均为细胞膜和细胞浆呈棕黄色。计数方法：每张切片取5个高倍镜视野，计数5个高倍视野内的阳性细胞总数，计算每高倍视野下阳性细胞均数。

1.4 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件进行数据处理。实验数据用均数±标准差±s）表示，两组间比较采用两样本均数t检验（方差不齐采用成组设计两样本比较的秩和检验）。

2 结 果

2.1 免疫组化染色 脑出血后血肿周围有明显的炎症细胞聚集，主要以单核巨噬细胞为主。

2.2 脑出血后血肿周围组织IL-8表达的动态变化 假手术组针道周围有少量IL-8表达，但无明显时间变化；模型组与治疗组血肿周围IL-8的表达在12 h升高，24 h达高峰，3 d开始下降，与假手术组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；主要在血管周围内皮细胞、神经胶质细胞的胞浆及胞核内表达。详见表1。

2.3 地塞米松对大鼠脑出血后血肿周围IL-8表达的影响治疗组与模型组比较各个时间点IL-8的表达均下降（P＜0.05）；高剂量组各个时间点IL-8的表达较低剂量组下降明显（P＜0.05）。详见表1。

表1 各组血肿周围组织IL-8表达的比较±s） 个／视野

表1 各组血肿周围组织IL-8表达的比较±s） 个／视野

组别12 h 24 h 3 d假手术组0.46±0.03 0.47±0.03 0.50±0.03模型组 0.52±0.03 7.20±0.31 5.32±0.37低剂量组 0.44±0.301） 5.84±0.141） 4.74±0.381）高剂量组 0.36±0.051）2） 3.55±0.261）2） 3.03±0.181）2）与模型组同一时间点比较，1）P＜0.05；与低剂量组比较，2）P＜0.05

3 讨 论

脑出血是严重危害人类生命健康的疾病，目前对脑出血尚无明确有效的治疗方法。临床上将甘露醇作为急性脑出血发病早期抗水肿的药物，早在1989年WHO就报道急性脑出血应用甘露醇易加重病情［3］，甘露醇在局部血脑屏障破坏后，可渗透至血管外脑组织间隙内，从而使局部渗透压升高，导致全身脱水而局部脑水肿反而加剧，形成所谓的“反跳现象”［4］，因此这类药物对于治疗脑出血有其局限性。止血剂应用的安全性和有效性也有待进一步观察，因此从血肿周围水肿带形成机制的角度来治疗脑出血备受关注。目前大量实验研究已经表明，脑出血后血肿内和血肿周围存在明显的炎症反应，潘新发等［5］列举了多种炎症细胞及炎症因子，并详细阐述了它们在其中发挥的不同角色，最终导致局部脑组织血流的下降、周围组织水肿的加重。

细胞因子是一类具有广泛生物活性的小分子蛋白质，大部分是在细胞间发挥信号传导的作用，与机体免疫反应、代谢、炎症反应及组织修复关系密切。近年来的深入研究表明，细胞因子在脑出血后血肿周围组织水肿的形成中有着重要的作用，其中IL-8就是一种在炎症早期发挥重要作用的细胞因子，主要由激活的单核巨噬细胞产生；其他如内皮细胞、成纤维细胞、上皮细胞、肝细胞等亦可在适宜的刺激条件下产生。IL-8可单独或共同协同其他炎性因子通过介导或直接、间接参与炎症反应导致内皮功能的异常［6］。王怀立等［7］通过应用脂多糖建立的脑水肿动物模型也证实IL-8参与脑组织含水量的增加和血脑屏障的破坏过程，是造成脑水肿发生的重要细胞因子之一。Yamasaki等［8］发现IL-8能促进白细胞浸润、聚集、细胞黏附和产生大量自由基并促进脂质过氧化和细胞因子的释放失调，导致脑毛细血管内皮细胞及基底膜损害，诱发血管源性水肿的发生和神经元损伤。Mukaida等［9］报道应用IL-8单克隆抗体或阻断IL-8释放可明显减轻炎性反应，阻止白细胞浸润，这些研究表明IL-8在脑出血中起着重要作用。

当处于明显的应激状态时，机体可释放大量糖皮质激素，超生理剂量时有强大的抗炎作用。地塞米松作为一种糖皮质激素，可以稳定细胞膜和溶酶体的活性，减轻氧自由基对局部组织损伤的反应，抑制磷脂酶，使炎性介质、血管活性物质生成减少，同时还可降低血脑屏障的通透性，增加局部大脑的血流量，改善缺血，从而减轻脑水肿，可以从炎症反应的角度治疗脑出血［10］。本研究就是从脑出血后血肿周围水肿带形成机制的角度来治疗脑出血，减轻局部脑水肿，改善脑出血预后，但对于地塞米松最终能否延长大鼠生命及其产生的副反应还有待进一步研究。

［1］ Gong C，Hof JT，Keep RF.Acute inflammatory reaction following experimental intracerebral hemorrhage in rat［J］.Brain Res，2000，871（1）：57-65.

［2］ Xue M，Del Biqio MR.Intracerebral injection of autologous whole blood in rats：Time course of inflammation and cell death［J］.Neurosci Lett，2000，283（3）：230-232.

［3］ 郭玉璞，王文志，李允德.中国脑血管病治疗专家论集［J］.沈阳：沈阳出版社，1995：34-43；80；137-142.

［4］ Nau R.Osmotherapy for elevated intracranial pressure：A critical reappraisal［J］.Clin Pharmacokinet，2000，38（1）：23-40.

［5］ 潘新发，万曙，詹仁雅.脑出血后血肿周围组织炎症反应的研究新进展［J］.国际神经病学神经外科学杂志，2010，37（3）：263-266.

［6］ 孔丽，胡云龙，赵三江，等.原发性肝癌患者血清TGF-β1和IL-8水平与预后的关系［J］.天津医学，2005，3（12）：75-41.

［7］ 王怀立，高东培，芦军萍，等.TNF-α、IL-8在脂多糖致大鼠脑水肿中的表达［J］.免疫学杂志，2002，18（6）：440-446.

［8］ Yamasaki Y，Matsuo Y，Matsuura N，et al.Transient increase of cytokine-induced neutrophil chemoattractant，a member of the interleukin-8 family，in ischemic brain areas after focal ischemia in rats［J］.Stroke，1995，26（2）：318-322.

［9］ Mukaida N，Matsumoto T，Yokoi K，et al.Inhibition of neutrophil-mediated acute inflammation injury by an antibody against interleukin-8（IL-8）［J］.Inflamm Res，1998，47（Suppl3）：151-157.

［10］ 徐侯宝.大剂量激素作用的受体机制以及危重病人激素治疗的新策略［J］.外科理论与实践，2000，5（2）：76-78.