肝豆状核变性的研究进展（一）

杨健

(海南医学院附属医院儿科，海南海口570102)

·综述·

肝豆状核变性的研究进展（一）

杨健

(海南医学院附属医院儿科，海南海口570102)

肝豆状核变性是一种常染色体单基因隐性遗传的铜代谢障碍疾病，其致病基因ATP7B定位于染色体13q14.3，编码一种铜转运P型ATP酶。1912年Kinnier Wilson首先报道本病，近年来WD的研究已取得喜人的进展。1989年WD基因被准确定位于13q14.3，1993年WD基因被成功克隆。本病的诊断主要采用血清铜蓝蛋白(Ceruloplasmin，CP)、血清铜、尿铜、肝实质铜及基因检测。治疗方法包括饮食治疗、药物治疗、手术治疗和对症治疗，其中药物治疗主要采用青霉胺、锌盐及曲恩汀(Trientine)。肝移植是唯一可以治愈本病的治疗措施，细胞移植治疗及基因治疗尚处实验研究阶段。本文就本病的历史研究进程及新近的诊治进展做一综述。

肝豆状核变性；诊断；治疗；进展

肝豆状核变性(Hepatolenticular degeneration，HLD也称wilson病，以下简称WD)是一种常染色体单基因隐性遗传的铜代谢障碍疾病，其致病基因ATP7B定位于染色体13q14.3，编码一种铜转运P型ATP酶。ATP7B基因突变导致ATP7B功能减弱或丧失，导致血清铜蓝蛋白合成减少以及胆道排铜障碍，蓄积体内的铜离子在肝、脑、肾、角膜等处沉积，引起进行性加重的肝硬化、锥体外系症状、精神症状、肾损害及角膜色素环(Kayser-Fleischer ring，k-F环)等[1-3]。本病的患病率大约为1/3万，而致病基因的携带率为1/90。现就本病的历史研究进程及新近的诊治进展综述如下：

1 历史沿革

1912 年Wilson[1]报道一种累及肝脏及大脑豆状核(Lenticular nucleus)的新疾病。尽管他耗尽终生精力去寻找成功的治疗方法，但却始终未能如愿。1913年Rumpel[4]发现这种患者死后的肝脏内含有大量的铜，因此，他推测铜是这种疾病的始作俑者。直到1948年止，本病的探索似乎被人们搁置下来而未予更大的关注。1948年Cumings[5]证明肝豆状核变性的患者大脑和肝脏内有大量的铜累积。这种发现使他联想到用英国刚生产的鳌合剂(Chelating agent)——抗路易士药剂(Antilewisite，也称Dimercaprol，二巯基丙醇，常用作砷、汞等中毒的解毒剂)来阻止疾病的进展。一般说来，在治疗学上的主要进展都是由许多跨国制药公司所创造的，它们生产的药物既安全又有效。然而，1982年Fred karch把治疗肝豆状核变性的药物归类为“罕用药”(Orphan drugs)范畴，迄今为止七个报批的新药都是由个别研究人员所发现。因此，可以说推动肝豆状核变性研究及取得的重要进展，大多是来自个别研究人员的成就而不是大公司所为。事实上，许多制药公司都按照自由市场经济的潜规则运作，它们研究和生产的新药主要针对常见病，因为只有这样才能获得巨额利润。现在介绍一个新药的费用大约需要8亿美元。基于上述原因，研究和和生产针对少见病的药物少有人问津，这也是情理之中的事情[6]。

WD的情况也是如此。到目前为止，所有能使用治疗的药物都是个体或小团队研究的产物。肝豆状核变性治疗的故事不是始于1948年Cumings建议用二巯基丙醇，早在1939年第二次世界大战时，由于害怕希特勒使用含砒霜的军用毒气——刘易士毒气(Lewisite)袭击不列颠群岛，在Rudolph peters爵士的领导下，一个牛津大学的生物化学教授小团队开始研究解毒剂。这项研究的成果于1945年公开发表[7]。他们设计的二巯基丙醇分子具有二个替代巯基(-SH)的短链醇(Short-chain alcohol)，上述巯基使二巯基丙醇牢固地结合砒霜中五个环，从而使后者失去活性。后来这种化合物便称作英国的抗路易士剂(British antilewisite，BAL)。Cumings推测这种化合物可能会阻止肝豆状核变性的进展，四年以后的1951年，Cumings[8]在伦敦，而Denny Brown和Porter在波士顿市医院[9]分别报道这种药物有效。然而，随着二巯基丙醇的反复使用，其疗效越来越差，而毒性反应高居不下的发生率却明显凸现出来。除此之外，尚有由于深部肌注所带来的通宵达旦的疼痛。

WD研究真正发生质的飞跃是发生在上世纪50年代，1952年，Bearn等[10]和Scheinberg等[11]分别报道肝豆状核变性患者血清铜运输蛋白——铜蓝蛋白(Caeruloplasmis)缺乏。尽管对它的确切意义不甚明了，但是此时人们已尝试通过许多手段，例如高蛋白饮食、皮质类固醇和鳌合剂乙二胺四醋酸(Ethylenediamine tetraacetic acid)来改善治疗。事实上，上述治疗措施没有一个有好处。

1951 年，沃尔什(Walshe)教授进入牛津大学医学院登特教授的代谢研究所工作并引进最新的纸色谱分析法(Paper chromatography)技术用于临床生物化学研究，结果发现有肝病表现的WD患者存在氨基酸代谢紊乱。其主要观察在肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma)部分肝切除(主要是左叶切除)期间患者的改变，他发现术后患者尿中排泄氨基酸，而这种情况术前从未发生过。这使人们自然而然地想到氨基酸移动到溶解体系中，其与含硫氨基酸——半胱氨酸(Cysteine，也称巯基丙氨酸)密切相关。沃尔什选用二甲基半胱氨酸(Dimethyl cysteine)作为溶解体系来研究氨基酸的移动，他指出二甲基半胱氨酸是青霉素(Penicillin)的降解产物，人们习惯称之为青霉胺。

根据这条线索，在术后他用青霉素治疗患者时，特别注意观察尿中是否出现氨基酸。不出所料，给予大剂量青霉素治疗的患者，其尿中都出现氨基酸，最后他证实[12]：所有应用青霉素治疗的患者都出现上述情况。

不久以后沃尔什获得富布莱特奖学金到哈佛大学医学院附属的波士顿市医院查尔斯·戴维森博士工作的肝病研究所进修，他主攻肝昏迷时大脑的氧耗量和肝昏迷时出现在患者血循环中各种毒素的影响。有一次戴维森对进行性肝功能衰竭的WD患者用二巯基丙醇处理，该患者有明显的假性震颤(Pseudosclerotic tremor)和水潴留。很久以前，人们就认识到青霉胺有特殊的分子结构能鳌合铜，其在巯基和氨基之间与铜结合形成一个环状复合物。戴维森博士有广泛的交际圈，他通过他的人脉从马萨诸塞州科技学院的约翰教授处获得2 g青霉胺。然而这时新的问题凸现出来了，那就是青霉胺的安全治疗剂量是多少？那个时代没有伦理委员会，不需要征求谁的许可。在实践中，根本没有哪个决定是建立在伦理指南之上的。患者服下溶在水里的1 g青霉胺24 h后未感觉任何不适，但是他们偶然发现：当水加入青霉胺后它立即变为鲜蓝色，这种非常意外的发现是由于巯基(-SH)和水中的铁之间产生的颜色反应，它似乎很安全。所以剩下的1 g青霉胺又给患者口服，结果发现患者尿中铜的排泄量明显增加，但是依然没有毒性反应。事实上，不发生毒性反应确实不足为奇。因为，用青霉素治疗的每个患者其尿中都有青霉胺排出。下一个问题是如何找到更多的青霉胺用于治疗患者。这时戴维森的关系网再次发挥作用，他从默克公司的医药主管Sharp和Dohme处得到支持，他们同意在小鼠身上做一些简单的毒性试验并送5 g多的青霉胺给他。但是非常遗憾，当把这些药物给患者服用时，却没有排出铜尿，这时他们想起半胱氨酸(Cysteine，巯基丙氨酸)会自动氧化为胱氨酸(Cystine，双硫丙氨酸)而失去巯基(-SH)，青霉胺很可能也有同样的反应。根据这个推测，默克公司的医药主管做了一个试验，他用氯化铁(Ferric chloride)做试验，结果没有呈蓝色，很明显他所给戴维森的青霉胺已失去自由的巯基了，估计其中的二甲基半胱氨酸(Dimethyl cysteine)已自动氧化成四甲基胱氨酸(Tetramethyl cystine)。在多次通信联系后，默克公司的医药主管表示歉意并希望不能因为这失误而影响WD的研究工作。非常幸运，席汉教授帮助他们与Mann's精制化学药品(Mann's Fine chemicals)公司联系并从那里获得50 g青霉胺，同时该公司提供使用说明书教会他们如何进一步做临床试验。沃尔什进修期满后返回英国继续上述研究，他发现从青霉素衍生而来的青霉胺是胺基酸的右旋异构体(D-isomer of the aminoacid)，而合成的青霉胺是由胺基酸的右旋异构体和左旋异构体(L-isomer)组成，其中只有左旋异构体有毒性。

随后，沃尔什转到剑桥大学工作并在医学院的附属医院成立查尔斯·登特代谢研究所，他把青霉胺装进胶囊给WD患者服用，在进行临床试验时他发现事情进展很顺利，因为患者既不询问伦理问题，也不考虑安全性，依从性相当好。总共有3个患者接受治疗，最初的实验结果表明[13]：这种新药治疗的前景的确很好，它与其他的药物不同，在单次治疗量后所有患者都排出大量的铜。他们曾担心在长期服用后可能会存在毒性，但所幸的是上述患者未发现任何问题。在试验后，二个患者继续用二巯基丙醇(BAL)治疗，其中一个患者不久后由于食管大出血而死亡，另一位患者数年后估计可能是由于效果不好或对二巯基丙醇不耐受而重新再用青霉胺。第一位接受青霉胺长期治疗的患者是一位女性，其用量是每天450 mg(现在认为这个剂量太小)，在9个月后尽管某些症状及体征依旧，但她严重的震颤麻痹综合征(Severe parkinsonian syndrome)开始得到改善，最后由于症状明显好转而得于成婚，婚后养育一个孩子。她50多岁后仍然继续服用青霉胺，不过一直没有明显的副作用。

20世纪60年代后青霉胺被选作WD的治疗药物[14-17]。荷兰神经病学家Schouwink[18]的研究表明：锌盐(Zinc salts)可有效地抑制肠道铜的吸收，因此可用于WD的治疗。然而，锌不能促进铜通过胆汁或尿液排泄，因此其降铜作用相当缓慢。随后荷兰的Hoogenraad等[19]和美国的Brewer等[20]分别继续研究锌盐疗法，他们都是这一疗法狂热的支持者。最后，美国食品及药物管理局(FDA)仅同意锌盐在下述情况下使用：即先用鳌合剂降铜后，再用锌盐作为维持治疗。与鳌合剂相比锌盐不但价格低廉，而且毒副作用小。假如把锌盐作为单一的治疗，那么它的作用就相当缓慢，它仅通过抑制肠道对铜的吸收而产生一种负铜平衡。Hoogenraad[21]和Brewer[22]于20世纪末曾经就锌盐这种疗法谁最先发现的问题公开论战，但事实上Schouwink[18]于1961年已做初步研究，他才是真正的功勋级人物。有关青霉胺毒副作用的报道不少[23-24]，其中最严重的是免疫反应导致系统性红斑狼疮和免疫复合物性肾炎。虽然这些毒副作用不多见，但它使青霉胺的临床应用备受争议[25-26]。事实上，在这个问题上真是“仁者见仁，智者见智”。如果用青霉胺连续治疗患者，那么他(她)有可能会因青霉胺肾病而导致肾衰竭死亡。但是，如果停用药物，那么他(她)也可以会因肝豆状核变性的症状而夭折。二巯基丙醇(BAL)只产生轻度的铜尿，但它可带来巨大的麻烦，因此，临床上摒弃它，不作为WD治疗的选择。

寻找新的鳌合剂已成为当务之急，理想中的鳌合剂应符合如下标准：(1)没有毒性；(2)可以口服；(3)其从尿中排泄铜的作用应不亚于青霉胺。用老鼠做实验研究多少有点不科学，许多复合物从结构上看很有希望成为理想中的鳌合剂，但实际应用没有一个有效果。沃尔什就此事专门请教生物化学教授狄克逊，后者建议使用三乙烯毒鼠强(Triethylene tetramine，也称三乙烯羟化四甲胺)，他指出三乙烯毒鼠强在生物化学上具有产生胺、精胺(Spermine)和亚精胺(Spermidine)的类似结构，因此经结构改造后可没有毒性。众所周知，三乙烯毒鼠强是工业化学品，习惯上用作环氧树脂硬化剂(Epoxyresin hardener)，它是一种强碱，pH值为14。因此，要通过中和作用把pH值降至7.2左右。由于它是商用化学品，其纯度仅在60%以下，所以要用于临床就必须生产出一种纯洁的结晶盐。事实上，要生产出纯洁的产品相当困难，先通过生成二盐酸化合物(Dihydrochloride)提高纯度，最后经过冷冻干燥(Freeze drying)把杂质除去。这种产品极容易潮湿，它必须储存在五氧化二磷(Phosphorus pentoxide)的环境。它的味道相当像无味的饼干，当把这种药给老鼠服用时，发现它无毒并能引起明显的铜尿。时光倒流到当时进行的临床试验，当单剂量给有WD肾病的患者服用时，发现患者排出大量的铜尿，并明显提示该药对WD的治疗具有良好的前锦[27-28]。若干年后，随着粗制的三乙烯羟化四甲胺治疗青霉胺不耐受患者数量的增加，越来越证明它是有价值的[29]。沃尔什的助手对该药进行有效负荷试验，他们把药物装进胶囊分给患者服用，这种自我负责的药理学冒险行为不可避免地终于遇到麻烦。2例对青霉胺发生早期毒性反应的新患者改用从新的供应商那里购买来的粗制三乙烯羟化四甲胺时，全部发生急性肾小管坏死。这次治疗立即被“叫停”。此时，他们从这批三乙烯羟化四甲胺中寻找有毒的杂质，曾疑及三氨乙基胺(Triaminotriethylamine)，但它又不象导致事故的罪魁祸首。因为各批次的三乙烯羟化四甲胺中都会有三氨乙基胺，并已用数年，但已往未见类似情况发生。药理学系的Grundy教授研究发现三氨乙基胺的分子式有可能是一种神经节阻滞剂，最后证实这种推论是正确的。随后不久，Hal Dixon采用一种十分完美的方法经过结晶化从无水酒精(Absolute alcohol)中提纯三乙烯羟化四甲胺(Triethylene tetramine)，紧接着他们用这种纯化的药品治疗患者，结果表明患者可以耐受。几周后接受治疗的患者病情得到明显的改善，正当她准备出院时，却发现已怀孕，这次怀孕是由于几周前她丈夫来医院探病时发生的。现在问题出现了：那种三乙烯羟化四甲胺对胎儿有影响吗？主管医生Hilda Bruce立即用老鼠做了一些初步实验，结果显示这种药没有致畸作用。非常幸运，妊娠很成功，足月后她产出一个正常的男婴。

Addenbrooke's医院药房能接受在实验室内生产高纯度的三乙烯羟化四甲胺用于治疗患者是一件勇敢的决定。要知道在今天没有政府的授权那是不可能的。然而，这样的药品来源只是杯水车薪，它不能最终解决药品供应的长期问题。就此事在剑桥(Cambridge)召开了一个专家会议，专题讨论罕见病的药用问题。参会人员有制药行业的代表、医疗失当保险公司、医学伦理学专家、感兴趣的医生和卫生部门。这个长期困扰临床工作者的问题最终获得解决，卫生部门同意掌管产品许可证并由政府的化学家负责把关厂家提供临床使用的三乙烯羟化四甲胺二氢氯化合物(Triethylene-tetramine-2-hydrochloride)的纯度。一家名叫寒武纪的化学药品子公司对生产这种药表现出很浓的兴趣，同意成为官方的供应商。在第一次临床使用15年以后，这个化合物终于获得政府正式的生产许可，并将商品名定为曲恩汀(Trientine)。似乎采用3种疗法——青霉胺、锌盐和曲恩汀就可以完全征服WD，其实不然，在人类攻克WD的漫漫长途中，到处布满荆棘和坎坷，一个问题解决了，又会冒出新的问题。早在1980年，一位16岁的女孩出现轻微的肌张力失常，她的家庭医生非常机敏，立即想到她可能罹患WD。因为，最近她的姐姐由于患了一种未确诊的神经综合征而死于伦敦一家医院。事实上，这位医生诊断非常正确，但所不幸的是她在刚开始用青霉胺治疗后便出现免疫反应(溶血性贫血)，随后改用曲恩汀治疗又发生免疫复合物肾炎。迫于无奈她只能停用上述两药而改服硫酸锌，在服药一年后她的临床情况还算平稳，但仍然有轻度的肌张力失常。她的肝活检提示有组织学恶化和肝铜含量飙升。她曾尝试用二巯基丙醇(BAL)，但很快又因为药物反应而出现顽固性高热。显然，对于这种患者已没有切实可行的治疗方案了。因此，寻找新的药物治疗已成为迫在眉睫的事情。众所周知，从事兽医工作的人都深深懂得，当牧场的牧草被钼污染后羊便会出现缺铜。1957年，Bickel等[30]根据上述事实尝试用钼酸盐(Molybdate)作为一个抗铜药使用。但是，在研究过程中他们发现钼酸盐在临床和生物化学上都不存在好处，造成这种误解是他们不认识到影响羊缺铜的另外的因素是富硫的牧草和皱胃(Abomasum，羊的第二胃，反刍动物胃的第四部分)内的还原，在那里钼酸盐被分解成四硫钼酸盐(Tetrathiomolybdate)，后者才是一种作用强的抗铜因子。四硫钼酸盐的纯化问题由莱斯特市蒙特福特大学(Montfort University)无机生物化学家斯图尔特·劳里(Stuart Laurie)教授解决。由于缺乏这种复合物在人体使用的毒性资料[31]，所以在别无选择的情况下，沃尔什在临床使用前自己服用4 d，经观察未发现临床和生物化学的毒性证据。劳里教授建议每天2次，每次30 mg服用。出乎意料的是：用药后患者血清铜含量明显增加，但尿铜仅轻度增多，血清铜在三氯乙酸(Trichloracetic acid)的可溶部分降低，这提示铜已经与蛋白质紧密结合。用放射性铜(Radioactive copper)研究表明：与服药前相比，服药后同位素铜越来越多地从血浆中缓慢地被清除。当口服放射性铜时，发现用四硫钼酸盐的患者几乎没有从肠道吸收铜，在这方面它的作用比锌盐更加有效[32]。用四硫钼酸盐治疗一年后，患者肝脏组织学完全恢复正常，血铜浓度降至治疗前的1/3，它与患者的临床症状、体征的改善完全一致。显然，这是一种有效的新疗法。然而，药源匮乏及价格昂贵依然困扰着患者。

20世纪80年代WD在治疗学上的另一个进展是：Scheinberg等[33]重新发现二巯基丙醇(BAL)的应用。他们发现对于一些严重的肌张力障碍患者，该药可促进症状的缓解。Yonetani等[24]也发现，对少数WD患者添加二巯基丙醇治疗非常有效。该药是一种较好的脂溶性和非极性(Non-polar)复合物，对一些患者来说二巯基丙醇更容易透过血脑屏障(Blood-brain barrier)。不得不承认的是，现在依然有少数患者对任何治疗都没有效，其中的原因尚不清楚，据估计可能与临床表型的异质性有关。迄今为止，虽然WD的基因突变只有400多种，但是杂合子的排列组合的数目是巨大的。

2 病因和发病机理

2.1 正常铜的代谢及功用正常人体内含铜100～200 mg，其中大部分分布或贮存于不同组织的蛋白质和血液中，以肝和脑的含量最高，各占总量的10%。肝脏是铜代谢的中心。正常人每日从饮食中摄入铜2.5～4 mg，主要通过胃、十二指肠和空肠上端吸收。入血的铜通过位于肠细胞膜的转运体蛋白(Transporter protein)-ATP7A的作用然后经门静脉进入血循环，再通过位于肝细胞窦状隙面的铜转运体(CTRI)进入肝细胞。进入肝细胞内的铜分为三部分：一部分参与铜蓝蛋白(Ceruloplasmin，CP)的合成；一部分结合到细胞色素C氧化酶、超氧化物歧化酶等重要的铜蛋白；另一部分分泌入胆小管经胆道直接排出体外。机体中许多酶含有铜，铜在机体的新陈代谢中起着各种各样的作用。如在细胞色素C氧化酶中，铜起着辅助因子(Co-factor)的作用，在生理状态下接受和传递电子[34]；成纤维细胞生成因子1(Fibroblast growth factor1)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-1α(IL-1α)、转化生长因子-β(TGF-β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等的释放离不开铜；在生物学上，活化的细胞外多肽(Extracellular polypeptides)参与炎症过程需要依赖铜的存在；在细胞培养中巨噬细胞或巨噬细胞依赖因子诱导T淋巴细胞的增生，铜是必不可少的[35-37]。在血管再生通路(Angiogenesis pathway)的许多环节中铜也起着关键作用[38-39]。

2.1.1 ATP7B蛋白(WD蛋白)ATP7B蛋白是一种铜转运P型ATP酶，仅在肝细胞内大量表达，在肝内对铜离子有吸收和分泌的二重作用。当肝细胞低铜时，ATP7B移动到高尔基体内内质网将铜离子转入高尔基体；当肝细胞内铜过量时，ATP7B移向肝细胞的小管面，将铜离子分泌入胆道使铜排出。

2.1.2 铜蓝蛋白基因的结构和功能铜蓝蛋白基因位于3q23～25，由21个外显子组成，长约45 kb，它所表达的铜蓝蛋白是一个132 kD的糖蛋白，属α2球蛋白。铜蓝蛋白(Ceruloplasmin，CP)大部分与铜离子结合形成6个铜离子的蛋白，称为全铜蓝蛋白(HOIO-CP)，少部分铜蓝蛋白不与铜结合，称为脱铜蓝蛋白(APO-CP)。铜蓝蛋白从肝细胞释放入血，它具有如下功能：①铜蓝蛋白是血中铜的主要携带者，负责携带血中90%～95%的循环铜，并作为铜的供体参与细胞色素C氧化酶和其含铜酶的合成；②具有亚铁氧化酶的作用，能氧化亚铁为高铁，同时使氧还原成水；③具有多酚氧化酶的作用，能氧化芳香二胺、儿茶酚胺、5-羟色胺、褐黑色素及维生素C等。

2.2 WD分子发病机制

2.2.1 WD基因的定位及克隆1989年WD基因被准确定位于13q14.3，1993年WD基因被成功克隆。WD基因编码的蛋白称为ATP7B酶或ATP7B蛋白或WD蛋白，该基因在肝、肾、胎盘高度表达，编码一个膜转运ATP酶，这是一种铜依赖性P型ATP酶。

2.2.2 WD基因的结构及特征WD基因长约80 kb，含有21个外显子(Exon)及20个内含子(in-tron)。WD基因是由1411个氨基酸组成的铜转运P型-ATP酶(P-type ATPase，ATP7B)。WD蛋白主要有三个功能区：①金属离子结合区；②P型ATP酶功能区(也称高度保守区)；③跨膜区(也称疏水区)。

2.2.3 WD的发病机制WD的发生主要是由于WD基因发生突变，其编码的P型ATP酶(ATP7B)发生了功能改变，若其功能部分或全部丧失，就会发生两种情况：①ATP7B不能和脱铜蓝蛋白(APO-CP)结合转化为铜蓝蛋白(CP)，其结果是患者血清铜蓝蛋白减少；②ATP7B不能将多余的铜离子分泌入胆道而排出体外，结果铜离子在肝细胞内沉积产生铜毒，过量的铜损害肝细胞的线粒体，产生过氧化损伤。另外，铜离子从肝细胞溢出进入血液，使体内其他器官如脑、肾、血细胞等的铜过度负荷并发生铜中毒。

2.3 WD基因的突变迄今为止，已报道的WD基因突变位点达400多个。世界上不同的地域或民族存在不同的WD基因突变热点。因此，基因检测位点的选择要注意种族特异性和针对性，避免无的放矢。一般说来，在欧美患者中，WD基因的高频突变点是14号外显子His1069Gln(H1069Q)，它位于WD基因的ATP结合区，突变改变了ATP蛋白上的ATP环，导致蛋白二级结构改变，从而影响其结合能力。而我国WD患者的高频突变点是8号外显子Arg778Leu(A778L)，此突变位于第4跨膜区，突变减弱了铜的转运。

2.4 WD与细胞因子的关系业已证明神经系统疾病如脑缺血、癫痫、脑外伤、多发性硬化、克-雅病(Creutzfeldt-Jakob disease)、肌萎缩侧索硬化、阿尔茨海默病和帕金森病时血清细胞因子含量增加，然而，它们在神经系统疾病病理生理学中的确定作用依然尚未明了[40]。在WD的病理生理学研究中，尽管人们一直深信患者各种组织内自由铜含量的增加可导致自由基的损伤。但是，以往的研究未发现WD患者的血清丙二醛(Malondialdehyde)含量明显高于对照组[41]。有关细胞因子在WD中作用的文献资料相当匮乏，所以说铜沉积导致组织损伤的机制在很大程度上依然是一个悬而未决的问题。基于上述情况有学者提出一种假说[42]，那就是：在WD的发病机制中铜引起细胞因子含量增高可能起着重要作用，临床上可通过药物减少组织铜的含量来降低血清细胞因子的浓度，从而减轻炎症反应和组织损伤。Goyal等[43]就上述问题进行了相关的研究。具体方法：通过比较未用药患者和使用去铜治疗患者血清各种细胞因子如白介素-2 (IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)、r-干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量。结果发现：WD患者血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α，P＜0. 001)、γ-干扰素(IFN-γ，P=0.005)、白介素-6(IL-6， P＜0.001)含量升高，并且在统计学上存在差异，而血清白介素-4(IL-4，P=0.49)和白介素-2(IL-2，P=0.11)的含量与对照组之间在统计学上不存在差异。

3 WD的病理学改变

3.1 肝脏光镜下可见肝细胞脂肪变性、坏死，胞核呈空泡状。最早期的肝细胞改变只能在电镜下发现。Dickersin对早期WD(无症状)的肝脏病理诊断标准：①线粒体增大、多形性，伴基质密度增高；②过氧化小体数目增多、体积增大、多形性；③滑面内质网囊泡形成；④三酰甘油空泡增加；⑤溶酶体内脂滴和铜沉积。Lecca等对74例WD患者的肝活检标本进行研究，将其病理改变从轻到重分为肝脂肪变性期、肝炎期、肝纤维变性期和肝硬化等4期。病程进展快者可呈亚急性黄色肝萎缩。光镜下可见肝脏假小叶外周肝细胞胞浆内有铜样(褐色颗粒状)沉积物。肝硬化期较有特征性的改变是出现马洛里小体(Mallory body)。

3.2 脾脏肿大，包膜增厚，光镜下见脾窦高度充血，脾包膜及小梁结缔组织增生，细胞内有许多细小的棕黄色颗粒(铜样物)。

3.3 脑部病变主要在基底节，以壳核最明显，次为苍白球及尾状核。其他如大脑皮质、丘脑、红核、黑质、齿状核、中脑、脑桥、小脑均可受累。壳核皱缩，严重者形成空洞。光镜见神经细胞变性坏死，胶质细胞反应性增生及胶质小结形成和水肿。电镜下见豆状核神经细胞呈变性坏死，细胞质膜断裂，毛细血管基底膜电子密度明显增高。

3.4 肾脏电镜下见肾曲管上皮细胞间隙明显增大，细胞连接减少，部分微绒毛弯曲呈分支状，出现融合现象，粗面内质网减少。

4 WD的临床表现

4.1 分期(1)症状前期：铜在肝、脑、肾、角膜等器官逐渐沉积，而无相应的临床表现；(2)症状期：由于铜的毒性作用而出现各种临床表现；(3)恢复期：经过治疗，症状获得部分或完全缓解；(4)稳定期：症状稳定，24 h尿铜水平较为稳定。

4.2 起病年龄及形式本病发病年龄多在5～55岁，3岁及72岁均有。起病多属缓慢，在典型的临床表现之前有一个前驱期，这期间铜累积在肝脏引起亚临床肝炎，随后发展为慢性间质性肝炎和发生神经精神症状。肝脏和神经症状千差万别。WD有时表现为：库姆氏阴性溶血性贫血(Coombs-negative haemolytic)，暴发性肝功能衰竭(Fulminant hepatic failure)和急性肾功能衰竭。

4.3 首发症状患者出生后即存在铜代谢障碍，5～10岁时肝内的铜处于饱和状态。一般说来儿科患者以肝病症状起病多见，形式多样化，可表现为急性或慢性肝炎，也有以暴发性肝炎表现发病者[44]。

4.4 肝病症状本病的病理生理过程是大量的铜首先堆积在肝脏，然后沉积在中枢神经系统、角膜、肾和其他器官，因而肝脏是本病最主要也是最早受累的靶器官。大约80%患者发生肝脏症状。儿童患者开始常出现转氨酶(AST、ALT)升高和非特异性慢性肝损害症状，如倦怠、乏力、食欲不振及发热等，以后可渐出现肝区痛、肝大、黄疸、蜘蛛痣、脾大、脾功能亢进、食管静脉曲张破裂出血、肝性脑病、腹水和特发性细菌性腹膜炎等进行性坏死后性肝硬化症状。慢性活动性肝炎发生于10%～30%的WD患者。

4.5 神经系统症状发生率93%～97%，由铜在中枢神经系统的过量沉积造成。其主要在基底节沉积，临床上突出表现是锥体外系病征。最早、最常见的症状是肢体震颤，多是单侧肢体尤以上肢先出现，可呈静止性、意向性或姿势性震颤，往往是几种震颤形式混合出现，震颤幅度可为细小或粗大，当震颤以上肢近端明显时，形成所谓“扑翼样震颤”。随病情进展，四肢、头颅、下颌等均可见震颤。构音障碍也是常见症状，由于咽喉、舌及面部肌肉强直所致，患者讲话缓慢，声音低沉含糊且无变化，断断续续，严重时不出声。流涎和吞咽困难很常见，重者不能吞咽，这是因咽喉肌肉和吞咽肌肉发生肌强直所致。肌张力障碍累及面部及口部肌肉时引起面具样脸、苦笑貌、怪异表情或口面部不自主运动。肌强直累及肢体及躯干时产生肢体强硬、动作缓慢、转变姿势困难等。不少患者因肢体强直、挛缩导致畸形。步态异常也普遍存在，表现为起步困难、拖曳而行，走路向两侧摇摆，或出现类似帕金森病的慌张步态。其他的锥体外系症状还有舞蹈动作、手足徐动等。另外常见症状如小脑损害导致共济失调、小脑性语言障碍、皮质功能损害引起进行性智力减退；下丘脑损害可产生肥胖、持续高热、高血压、发作性昏迷等。

4.6 精神症状10%～51%的患者发生精神症状，约20%患者曾在确诊WD之前按各种精神病治疗。精神症状主要表现为情感障碍，如冷漠、抑郁、欣快、兴奋躁动、恐惧、强哭强笑等。动作及行为异常，如幼稚动作、怪异行为、生活懒散、喃喃自语、攻击行为、违拗，少数患者有自杀行为。部分患者有各种妄想、思维迟钝、幻觉、人格改变。不少患者有认知功能障碍。WD患者的精神症状有时持续很久，虽经驱铜治疗也无明显效果，晚期可有痴呆。

4.7 角膜色素环(Kayser-Fleischer环，K-F环)角膜K-F环最早由德国眼科专家Kayser(1902)和Fleischer(1903)分别报道而得名，被公认为WD的特征性临床改变[45]。K-F环是由于铜沉积于角膜后弹力层所致。绝大多数见于双眼，个别见于单眼，此环宽约1.3 mm，多呈黄棕色或黄绿色，有时是双环。K-F环明显时用电筒式放大镜可窥及，但早期常须借助裂隙灯始能发现。婴幼儿患者不容易发现此环，但随着年龄增长，角膜后沉积的铜离子越来越多，K-F环才明显。K-F环明显与否和病情轻重、治疗效果不一定相关。

4.8 肾脏症状铜在肾脏沉积主要损害近端肾小管，因肾小管重吸收功能障碍，出现肾性糖尿、氨基酸尿、磷酸盐尿、尿酸尿、高尿钙、蛋白尿和肾钙质沉积症。镜下轻度血尿较常见。此外，部分患者还可发生肾小管性酸中毒。

4.9 血液系统症状有些患者以急性溶血危象起病，这可能是由于患者肝细胞内的铜向溶酶体转移的速度过快，引起溶酶体损害，导致肝细胞坏死，大量的铜从坏死的肝细胞中释出，进入血液，破坏红细胞的结构，产生严重的Coomb's阴性溶血性贫血，其死亡率相当高。此外，鼻出血，牙龈出血及皮下出血等常见。

4.10 肌肉骨骼症状WD患者的骨骼及肌肉损害不少见，肌肉症状主要表现为肌无力、肌痛、肌萎缩。骨质疏松见于2/3的患者，其他如骨及软骨变性、关节畸形、X型腿、自发性骨折、肾性佝偻病等也可发生。四肢关节均可发生病变，尤以膝关节多见，常有关节疼痛及僵硬，易误诊为风湿性或类风湿性关节炎。

4.11 眼部症状WD患者除了具有特征性的K-F环外，约17%的患者出现白内障，特征是向日葵样分布，主要由于铜在晶体沉积所致。此外，还有暗适应能力下降、外斜视、集合力不足、瞳孔反应迟钝及调节减弱等。

4.12 其他症状部分患者皮肤色素沉着，皮肤较黑，尤以面部及双小腿外侧明显，当症状好转时可见色素沉着减轻，皮肤转白。此外，WD患者有时尚有心律失常、心电图异常、葡萄糖耐量异常及甲状腺功能低下等。

4.13 儿童WD的临床特点患儿3岁即可起病，以7～12岁多见。约占半数以上的患儿以肝病症状开始。年龄越小，以肝病症状起病越多，临床上可表现为急性或慢性肝炎的过程，也有以暴发性肝炎表现发病者，常常被误诊为病毒性肝炎，主要症状为食欲不振、疲乏、嗜睡、黄疸及腹痛等，体征表现为肝脾肿大、肝区疼痛和浮肿等，可出现脾大、腹水、出血倾向、食道静脉曲张等肝硬化表现，偶可见急性或亚急性黄色肝萎缩，导致严重肝功能衰竭，可在数周内死亡。约20%以神经系统异常为首发症状，一般说来，神经、精神症状以较大儿童多见，多在肝病症状数月、数年后出现。主要表现为锥体外系症状，常见肌张力不全、步态异常、躯干扭转痉挛、构音障碍、吞咽困难、流涎、表情呆板、肢体震颤，也可有行为改变和学习困难。年长儿有时可有抑郁、人格改变或精神分裂症样表现，个别有小脑共济失调、癫痫、轻偏瘫及锥体束征等，年幼儿K-F环多为阴性。(待续)

[1]Wilson SAK.Progressive lenticular degeneration:a familial nervous disease associated with cirrhosis of liver[J].Brain,1912,34: 295-507.

[2]Bull PC,Thomas GR,Rommens JM,et al.The Wilson disease gene is a putative copper transporting P-type ATPase similar to the Menkes gene[J].Nat Genet,1993,5:327-337.

[3]Sternlieb I.Perspectives on Wilson's disease[J].Hepatology,1990, 12:1234-1239.

[4]Rumpel A.Ueber das wesen und die bedeutung der leberveranderungen und der pigmentierunen bie den damitverbundenen fallen von pseudosklerose,zugleich ein beitrag zur lehre von der pseudosklerose(Westphal-Strumpell)[J].Dtsch Z Nervenheilk,1913,49:54-73.

[5]Cumings JN.The copper and iron content of brain and liver in the normal and in hepato-lenticular degeneration[J].Brain,1948,71: 410-415.

[6]Walshe JM.The conquest of Wilson's disease[J].Brain,2009,132: 2289-2295.

[7]Peters RA,Stocken L,Thompson RHS.British anti-lewisite(BAL) [J].Nature,1945,15:66.

[8]Cumings JN.The effect of BAL in hepatolenticular degeneration [J].Brain,1951,74:10-22.

[9]Denny Brown D,Porter H.The effect of BAL(2,3dimercaptopropanol)on hepatolenticular degeneration(Wilson's disease)[J].N Engl J Med,1951,245:917-925.

[10]Bearn AG,Kunkel HG.Biochemical abnormalities in Wilson's disease[J].J Clin Invest,1952,31:616-620.

[11]Scheinberg IH,Gitlin D.Deficiency of caeruloplasmin in patients with hepatolenticular degeneration(Wilson's disease)[J].Science, 1952,116:484-485.

[12]Walshe JM.Disturbances of aminoacid metabolism following liver injury[J].Q J Med,1953,22:483-505.

[13]Walshe JM.Wilson's disease.New oral therapy[J].Lancet,1956, 267:25-26.

[14]Boudin G,Pepin B,Barraine R.Notre experience du traitment de maladie de Wilson par la penicillamine[J].Bull Soc Med Hop Paris,1963,114:631-642.

[15]Lange J.Zu diagnostik und therapie der hepatozerebralen degeneration(Morbus Wilson)[J].Dtsch Med Wschr,1963,88:896-900.

[16]Sternlieb I,Scheinberg IH.Penicillamine therapy in hepatolenticular degeneration[J].JAMA,1964,189:748-754.

[17]Deiss A,Lynch RE,Lee GR,et al.Long term therapy in Wilson's disease[J].Ann Intern Med,1971,75:57-65.

[18]Schouwink G.De hepato-cerebral degeneration(met een onderzoek van de zinknkstofwisseling)[C].Arnhem:Van der Wiel,1961.

[19]Hoogenraad TU,Koevoet R,Ruyter Korver EGWM.Zinc sulphate as long-term treatment in Wilson's disease(hepatolenticular degeneration)[J].Eur Neurol,1979,18:205-211.

[20]Brewer CJ,Prasad AS,Cossack ZT,et al.Treatment of Wilson's disease with oral Zinc[J].Clin Res,1981,29:758.

[21]Hoogenraad TU.Zinc treatment of Wilson's disease(editorial).J Lab Clin Med,1998,132:240-241.

[22]Brewer GJ.Treatment of Wilson's disease with zinc[J].J Lab Clin Med,1999,134:322-324.

[23]Walshe JM.Hudson memorial lecture.Wilson's disease:genetics and biochemistry,their relevance to therapy[J].J Inherit Metab Dis 1983,6(Suppl 1):51-58.

[24]Yonetani L,Walshe JM.Surviving Wilson's disease[J].Clin Med, 2001,1:72-74.

[25]Brewer GJ.Penicillamine should not be used as an initial therapy in Wilson's disease[J].Mov Disord,1999,14:551-554.

[26]Walshe JM.Penicillamine:the treatment of first choice for patients with Wilson's disease[J].Mov Disord,1999,14:545-550.

[27]Walshe JM.Management of penicillamine nephropathy in Wilson's disease:a new chelating agent[J].Lancet,1969,293:1401-1402.

[28]Walshe JM.Copper chelation in patients with Wilson's disease A comparison of penicillamine and treithylene tetramine dihydrochloride[J].Q J Med,1973,42:441-452.

[29]Walshe JM.Assessment of treatment of Wilson's disease with triethylene-tetramine 2HCl(Trien 2HCl).//Sarker B,editor.Biological aspects of metals and metal related diseases[C].New York:Raven Press,1983.

[30]Bickel H,Neale FC,Hall G.A clinical and biochemical study of hepatolenticular degeneration(Wilson's disease)[J].Q J Med,1957, 26:527-558.

[31]Walshe JM.Hudson memorial lecture.Wilson's disease:genetics and biochemistry,their relevance to therapy[J].J Inherit Metab Dis,1983,6(Suppl 1):51-58.

[32]Walshe JM.Tetrathiomolybdate(MoS4)as an anticopper agent in man.In:Scheinberg IH,Walshe JM.Orphan diseases and orphan drugs[C].Manchester University Press,1986.

[33]Scheinberg IH,Sternlieb I.Wilson's disease[C].New York:WB Saunders Company,1984.

[34]Schilsky ML.Diagnosis and treatment of Wilson's disease[J].Pediatr Transpl,2002,6:15-19.

[35]Landriscina M,Bagala C,Mandinova A,et al.Copper induces the assembly of a multiprotein aggregate implicated in the release of fibroblast growth factor 1 in response to stress[J].J Biol Chem, 2001,276:25549-25557.

[36]Omoto A,Kawahito Y,Prudovsky I,et al.Copper chelation with tetrathiomolybdate suppresses adjuvant-induced arthritis and inflammation-associated cachexia in rats[J].Arthritis Res Ther,2005,7: 1174-1182.

[37]Percival SS.Copper and immunity[J].Am J Clin Nutr,1998,67: 1064-1068.

[38]Watanabe T,Seno M,Sasada R,et al.Molecular characterization of recombinant human acidic fibroblast growth factor produced by E. coli:comparative studies with human basic fibroblast growth factor [J].Mol Endocrinol,1990,4:869-879.

[39]Ziche M,Jones J,Gullino PM.Role of prostaglandin E1 and copper in angiogenesis[J].J Natl Cancer Inst,1982,69:475-478.

[40]Lucas SM,Rothwell NJ,Gibson RM.Role of inflammation in CNS injury and disease[J].Br J Pharmacol,2006,147:232-240.

[41]Sinha S,Christopher R,Prashanth LK,et al.Malonialdehyde levels in Wilson's disease?[J].Ann IndianAcad Neurol,2004,7:507-510.

[42]Brewer GJ.Tetrathiomolybdate anticopper therapy for Wilson's disease inhibits angiogenesis,fibrosis and inflammation[J].J Cell Mol Med,2003,7:11-20.

[43]Goyal MK,Sinha S,Patil SA,et al.Do cytokines have any role in Wilson's disease[J].Clin Exp Immunol,2008,154(1):74-79

[44]Roberts EA,Schilsky ML.American Association for Study of Liver Diseases(AASLD).Diagnosis and treatment of Wilson disease:an updata[J].Hepatology,2008,47(6):2089-2111.

[45]Suvarna JC.Kayser-Fleischer ring[J].J Postgrad Med,2008,54(3): 238-240.

R442.8

A

1003—6350（2013）06—0892—07

10.3969/j.issn.1003-6350.2013.06.0383

2013-01-24)

杨健。E-mail：wenxiaomei0898@126.com