蜜蜂王浆主蛋白(MRJPs)基因家族结构与功能概述

梁庆环，李江红，梁 勤，陈大福

(福建农林大学蜂学学院，福州 350002)

蜂王浆是由工蜂头部的王浆腺与上颚腺分泌的特殊浆状物质，最新的研究表明工蜂头部的头唾腺和胸唾腺也参与分泌部分物质(Fujita et al.，2013)。蜂群内蜂王浆主要被用于饲喂蜂王和3 日龄以内蜜蜂幼虫，是蜜蜂级型分化的物质基础。蜂王浆中的蛋白质含量约占其干重的50%(Rembold，1987;Kohno et al.，2004)。王浆蛋白主要分为水溶性蛋白和非水溶性蛋白，其中水溶性蛋白约占总蛋白的46%～89%，为王浆蛋白的主要部分，称为王浆主蛋白(major royal jelly proteins，MRJPs)(Takenaka and Echigo，1983)。编码MRJPs 的基因构成一个基因家族(mrjps)，目前MRJPs 基因家族已鉴定出9个成员，依次命名为mrjp1～9(Klaudiny et al.，1994a;Schmitzova et al.，1998;Albert et al.，1999a，2004;Drapeau et al.，2006)。其中前五个成员的表达产物即MRJP1～5 在蜂王浆中含量比较丰富，仅MRJP1 就占水溶性蛋白总量的48%(Schmitzova et al.，1998)，而MRJP6～9 在王浆中的含量较少或者没有，通常在SDS-PAGE 胶中不能检测出来。另有研究发现mrjps 家族中还存在一个编码不完整多肽的假基因被命名为mrjp-ψ(Drapeau et al.，2006)。MRJPs自发现以来就引起了研究者的广泛关注，是蜂王浆各项生理功能的物质基础。本文主要对mrjps 家族近年来的研究成果进行综述，期望能为mrjps 家族的进一步研究和应用提供参考和依据。

1 mrjps 家族的鉴定

早在1960年研究者就利用色谱层析和电泳等技术探索王浆中蛋白质的组成、免疫特性及对比分析不同种类蜜蜂王浆蛋白的异同等(Patel et al.，1960;Tomoda et al.，1974，1977;Halberstadt，1980;Lensky and Rakover，1983;Thrasyvoulou，1983;Takenaka，1984;Otani et al.，1985;Yatsunami et al.，1987;Knecht and Kaatz，1990;Hanes et al.，1992;Kubo et al.，1996)。至上世纪九十年代，人们开始关注王浆中单组分的特征，陆续开展了王浆中酶类、mrjps 家族各成员的分离和鉴定工作(Kratky，1931;Gontarski，1949;Halberstadt，1970;Kramer et al.，1980，1982)。mrjps 家族各成员正是在这一背景下逐个鉴定出来。

mrjp1 1992年，Hanes 等(1992)利用等电聚焦的方法将王浆中一种糖蛋白分成八个等电点相似(PI 4.5～5.0)的蛋白条带，后来证实此类糖蛋白就是分子量大小为55 kDa 的MRJP1(Schmitzova et al.，1998);1994年，Klaudiny 等(1994a)通过构建8 日龄哺育蜂头部的cDNA 文库，筛选出3个与表达丰度较高的mRNA 相对应的cDNA 克隆，其中一个被命名为rjpx 的cDNA 就是后来被鉴定为mrjp1 的部分序列;此后，Ohashi等(1997)报道了了一个命名为p56kp-4 的cDNA 序列，编码一个分子量大小为56 kDa 的王浆主蛋白;次年，Schmitzova 等(1998)通过克隆测序发现了一个与p56kP-4 核酸序列完全一致的克隆(rjp120)，其大小为1444 bp(包含19 nt polyA)，编码产物为同一种王浆蛋白。随后通过氨基酸N-端测序的方法，验证了王浆中55 kDa 蛋白的N-端氨基酸序列与rjp120 所编码蛋白的N-端氨基酸序列相一致。至此，研究者将其正式命名为mrjp1。

mrjp2 Schmitzova 等(1998)利用斑点杂交技术发现了一些与rjpx cDNA(mrjp1)杂交时呈现出不同程度杂交信号的克隆，经测序发现其中的3个克隆是rjp120 cDNA 的同源物。对含有最长cDNA 插入片段的克隆测序发现，该cDNA 片段由1579个碱基组成(包含18 nt polyA)，编码452个氨基酸，鉴于它是mrjp1 的同源物遂将其命名为mrjp2。经氨基酸N-端测序分析，发现其序列与王浆中49 kDa 的蛋白相一致。

mrjp3和mrjp4 Klaudiny 等(1994a)人通过构建8 日龄哺育蜂头部的cDNA 文库，筛选出了三个与表达丰度较高的mRNA 相对应的cDNA 克隆，其中的两个克隆rjp57-1和rjp57-2(后来它们被依次命名为mrjp3和mrjp4)所编码的蛋白质是同源序列，并与王浆主蛋白序列具有高度的相似性。后来，Ohashi 等(1997)人对一个编码64 kDa 王浆蛋白的cDNA 进行克隆测序，发现它与rjp57-1的序列一致，由此认定rjp57-1 克隆中的cDNA 序列编码64 kDa 的王浆蛋白。Schmitzova 等(1998)通过氨基酸N-端测序，发现王浆中60～70 kDa大小的蛋白质条带其N-端序列与RJP57-1 的完全一致，证实了Ohashi 等人的研究结论并将其命名为MRJP3，同时将与之同源并由rjp57-2 编码的蛋白序列命名为MRJP4。

mrjp5 Albert 等(1999a)通过克隆测序并与已知的mrjps cDNA 序列比对，发现了一组与所有已知的mrjps cDNA 具有同源性但不一致的序列，随后经过核酸序列和氨基酸序列分析认为它是mrjps 基因家族中的一个新的成员，并将其命名为mrjp5。Schmitzova 等(1998)经过氨基酸N-端测序认定其编码王浆中分子量大小为77～87 kDa 的一种王浆主蛋白。

mrjp6，mrjp7和mrjp8 Albert 等(2004)利用已知mrjps cDNA 序列(MRJP1～5)对蜜蜂头部的EST 文库进行BLAST 检索，发现除了包含五个已知的mrjps 序列外还得到了三个与已知mrjps 具有高度同源性的序列，经过进一步的分析研究者认为它们各编码一种新的MRJPs 蛋白，于是将它们依次命名为MRJP6、MRJP7和MRJP8。

mrjp9 Peiren 等(2005)在对蜂毒进行蛋白组学分析时，发现了一种与MRJP8 氨基酸序列相似的蜂毒蛋白;Santos 等(2005)在对非洲哺育蜂的王浆腺进行蛋白质组学分析时，发现了与mrjps基因家族中已知成员具有较高同源性的蛋白质片段，后来Albert 等(2007)获得了编码该蛋白相对应的基因并命名为mrjp9。

mrjp-ψ通过对意蜂基因组的BLAST 检索，Drapeau 等(2006)发现了一个编码不完整多肽的假基因，并命名为mrjp-ψ。而转录水平上的研究发现该基因在蜜蜂体内并没有发生表达，研究者因此认为，该基因是蜜蜂的一个无效基因。

2 mrjps 家族特点

mrjps 家族各成员的核酸序列和氨基酸序列均呈现出较高的同源性，在结构上也有一定的相似性。mrjps 家族一般 cDNA 序列约为1200～1800 bp，外显子/内含子的结构高度保守，每个基因的编码序列中都含有5个内含子，且内含子的相对位置相对较一致，只是是内含子的大小和序列不同。其中mrjp2、mrjp3和mrjp5 基因存在重复序列的多态性(Schmitzova et al.，1998;Albert et al.，1999b;Albertov et al.，2005);而 mrjp3、mrjp4、mrjp5和mrjp7 的基因序列存在较丰富的单核苷酸多态性(SNPs)(Albert and Klaudiny，2004)。

mrjps 家族蛋白序列特征:已知的MRJPs 家族各成员的N-端序列都具有疏水性区域，该区域除了具有N 链接糖基化位点外，还具有信号肽，表明该蛋白质家族属于分泌蛋白，可由细胞中合成后分泌出胞外(Klaudiny et al.，1994a;Drapeau et al.，2006)。另有研究表明该家族成员的氨基酸序列中均含有四个高度保守的半胱氨酸。mrjps 家族各成员还具有相似的免疫学特性，它们之间共享类似的抗原区，均含有七个抗原保守区，相当于anti-MRJP1抗原决定部位(Peixoto et al.，2009)。mrjps 家族各成员的结构特征具体如下:

mrjp1 编码一种分子量为55 kDa 的弱酸性糖蛋白，对应的cDNA 大小为1430 bp，编码432个氨基酸，其N-端含有一个由19个氨基酸残基组成的信号肽。该蛋白在王浆中以单体和/或低聚物的形式存在，低聚物分子量约为350～420 kDa(Ohashi et al.，1997;Simuth，2001;Bíliková et al.，2002;Kimura et al.，2003)，由MRJP1 单体和5 kDa Apisimin 经非共价连接而成(Sano et al.，2004;Santos et al.，2005;Scarselli et al.，2005;Li et al.，2007)。MRJP1 的分子量和pI 呈现出一定幅度的波动，主要是由其糖基化的差异造成(Su et al.，2005)。mrjp1 的序列长度为3038 bp，由6个外显子和5个内含子组成。Malecova 等(2003)发现的mrjp1 序列与之前两次单独发表的cDNA 序列之间多处存在差异，但并未改变其编码蛋白质的氨基酸序列。Kucharski 等(1998)对mrjp1 的cDNA 进行测序，发现其翻译的蛋白质序列中第9位的由半胱氨酸代替了精氨酸。因此，不同蜜蜂样本之间的mrjp1 存在微小的差异。

mrjp2 编码一种分子量为49 kDa 的糖蛋白(Kohno et al.，2004;Sano et al.，2004;Santos et al.，2005;Scarselli et al.，2005;Li et al.，2007;)，该蛋白所对应的cDNA 大小为1544 bp，编码512个氨基酸，其C-端存在一个由NQKNN为基本重复单元组成的重复区，该区内存在的大量富氮氨基酸使之成为了氮元素的储存库。该蛋白序列中存在两个糖基化位点使其呈现出一定的多态性(Su et al.，2005)。与意蜂mrjp2 相似，中华蜜蜂mrjp2 也具有多态性(Su et al.，2005)。

mrjp3 编码一种分子量为60～70 kDa 的糖蛋白(Schmitzova et al.，1998)，该蛋白所对应的cDNA大小为1830 bp，编码610个氨基酸。在其C-端也存在的富氮重复区(Albert et al.，1996)由两种可区分的片段组成，其中靠近N-端的片段比较保守，此重复区由长度为15 bp 编码NQNA(D/N/G)或(K/R)QN(D/G)N 的五肽基本重复单元构成(Albert et al.，1999b)。

mrjp4 编码一种分子量为53 kDa 的糖蛋白，该蛋白所对应的cDNA 大小为1612 bp，编码464个氨基酸。与MRJP1、MRJP2、MRJP5 相比，该蛋白中必需氨基酸的总含量较低，但部分必需氨基酸如Leu(9.7%)、Val(8.0%)等则含量较多(Schmitzova et al.，1998)。另有研究表明该蛋白的编码基因中存在多个SNP 位点，并且这些位点上碱基的替换通常会导致其编码氨基酸的改变(Albert and Klaudiny，2004)。

mrjp5 编码一种分子量为77～87 kDa 的糖蛋白，该蛋白所对应的cDNA 大小为1965 bp，编码598个氨基酸。其蛋白序列中存在一个重复单元为DRM 的三肽重复区，该区域发挥着富集氮元素和硫元素的功能。MRJP5 的重复区比MRJP3 的重复区长，但重复单元保守性相对较低。它们之间唯一共有的特征是:带正电荷精氨酸/赖氨酸残基和带负电荷天冬氨酸残基呈现出一定的规律性，这暗示该家族的重复性区域可能单独进化了两次(Albert et al.，1999a;Drapeau et al.，2006)。

mrjp6 编码一种分子量为47 kDa 的糖蛋白，该蛋白所对应的cDNA 大小为1529 bp，编码437个氨基酸，与MRJP5 具有高度的同源性。其序列中也存在 DRM 的三肽重复区(Albert et al.，1999a)，该基因所有内含子的结构与mrjp1 相同(Malecova et al.，2003)。此外，mrjp6 的5’非编码区存在一个被命名为内含子0 的“基因化石”，其在mRNA 加工期间因某种原因导致无法剪切和拼接，从而成为mrjp6 mRNA 中的一部分。mrjp6 cDNA 的5’非编码区也因此显著长于其它mrjps(34～55 bp)(Albert and Klaudiny，2004)。

mrjp7 编码一种分子量为48 kDa 的糖蛋白，该蛋白所对应的cDNA 大小为1427 bp，编码442个氨基酸，与MRJP2、MRJP6 蛋白序列的相似性分别为73.0%，66.7%，编码序列中有两个SNP 位点，但并未改变编码蛋白质的氨基酸序列。研究表明中华蜜蜂MRJP7 与意大利蜜蜂MRJP1、MRJP2、MRJP3和MRJP5 四种王浆主蛋白序列相似性分别为67%、72%、66%和78%，与已报道的中华蜜蜂MRJP5 蛋白序列的相似性为73%(Albert and Klaudiny，2004)。另有研究证实MRJP7 的多克隆抗体可用于检测多种MRJPs，由此说明mrjps 基因家族成员之间具有高度的同源性。

mrjp8和mrjp9 的基因序列中缺少体现MRJPs营养功能的富氮重复区(Albert and Klaudiny，2007)。通过测序发现MRJP8 的cDNA 序列中由于存在内含子，导致其cDNA 的5’非编码区不能完全确 定(Albert and Klaudiny，2004)。MRJP9 cDNA 大小为1859 bp，含有一个完全开放阅读框编码423个氨基酸的蛋白质。

3 mrjps 家族的进化

mrjps 家族的9个成员以串联排列的形式位于一个大小约为60 kb 的DNA 片段内。1999年，Albert 等通过核酸遗传进化分析和蛋白质亲缘距离分析，发现该基因家族为单系群进化模式(Albert et al.，1999a)，即该家族中所有成员是由一个共同的祖先进化而来。鉴于当时的mrjps 家族只包含其中的前五个成员(mrjp1～5)，故该分析具有很大的局限性。

随着mrjps 家族其它成员的相继发现。Albert等对包含了mrjp1～8 共八个成员的mrjps 家族再次做了遗传进化分析，证实了之前研究结论的同时，还发现该基因家族中mrjp8是较早分化出来的一个基因，但是其它成员的分化顺序当时并不明确(Albert and Klaudiny，2004)。

后来，Drapeau 等通过对mrjps 家族的内含子/外显子基因结构和蛋白质序列进行研究，证实了Albert 等这方面的研究成果，并进一步的提出了MRJPs 基因家族中各成员是由yellow-e3 这一共同祖先在其进化的后期通过多次复制演变而来的假说。主要依据如下:1)在基因组中yellow-e3 基因位于mrjps 基因簇的一侧;2)yellow-e3 基因的内含子/外显子结构和蛋白序列与mrjps 家族成员存在较高的相似度;3)微阵列表达数据表明yellow-e3 基因和mrjps 的功能存在较多的共同点(Drapeau et al.，2006)。

系统进化相关研究还发现mrjps 家族中各成员以两两组合的方式出现在进化树的末端，即mrjp5和mrjp6，mrjp2和mrjp7，mrjp8和mrjp9 分别聚类在一起，从进化的角度分析，进化树末端的两个成员之间应当具有相对较近的亲缘关系(Drapeau et al.，2006)。

4 mrjps 家族的功能

蜂王浆是蜜蜂幼虫不可或缺的食物，作为王浆主要组分的MRJPs 与蜜蜂的生长发育和级型决定等生物学过程密切相关。研究表明MRJPs 中包含大量必需氨基酸(Schmitzova et al.，1998;Albert et al.，1999a)，多数都含有富氮重复区(Albert et al.，1999a，1999b)，某些成员(MRJP5)的蛋白序列中还存在着富集硫元素的三肽重复区(Drapeau et al.，2006)，这样的氨基酸构成决定了该家族具有重要的营养功能，能为蜜蜂的生长发育提供必要的营养物质。近年来，随着研究的不断深入，mrjps 不同成员在蜜蜂体内的表达及除营养之外的其他功能也逐渐被发现，使得对mrjps 的认识更上了一个台阶，以下对mrjps家族中各成员的表达与功能逐一论述。

mrjp1 作为编码王浆中含量最多的一种主蛋白，在蜜蜂体内表达广泛。研究证实mrjp1 不但在成年工蜂各阶段表达(Klaudiny et al.，1994b;Hanes and Simuth，1997;Ohashi et al.，1997;Huang et al.，2012)，而且在蜂王和雄蜂体内也有表达(Drapeau et al.，2006);就表达部位而言，该基因在蜜蜂的覃形体(Kucharski et al.，1998;Garcia et al.，2009;Peixoto et al.，2009;Hojo et al.，2010)、视神经叶(Peixoto et al.，2009)、触角神经叶、光叶以及脑细胞的细胞质(Rosmilah et al.，2006)等部位均被检测到表达，这意味着该基因可能与蜂蜜的成熟、行为调控、神经系统的发育等有关。Royalactin 作为MRJP1 的单体，在蜜蜂的级型分化过程中发挥着决定性作用，能够诱导幼虫发育为蜂王(Masaki，2011)。众多的研究还证实MRJP1 及其酶解产物具有多种生物学活性，如抗疲劳、抗肿瘤、刺激细胞生长、辅助伤口愈合、保护肝脏、促进肝细胞再生、降血压、提高免疫力、促进细胞增殖以及参与王浆对异体产生的过敏反应等(Kamakura et al.，2001;Drapeau et al.，2006;Majtán et al.，2006，2009;Rosmilah et al.，2008;Shen et al.，2010)。

mrjp2 编码的蛋白在王浆中的含量较MRJP1少，但其必需氨基酸的含量则高达47%。MRJP2仅在哺育蜂和产卵工蜂的王浆腺中表达而在采集蜂中不表达(Nakaoka et al.，2008)，表明该基因在蜜蜂体内发挥着重要的营养功能。通过比较产卵工蜂和正常工蜂的基因表达谱发现，mrjp2 在前者中的表达水平显著性的低于后者，说明该基因可能与产卵工蜂的卵巢激活与正常工蜂的不育有关(Thompson et al.，2006);通过对哺育蜂和采集蜂头部(去除咽下腺)的蛋白质组学分析，发现mrjp2 在哺育蜂的头部表达，这与哺育蜂的职能及蜜蜂级型分化中王浆的功能相一致，据此认为MRJP2 参与蜜蜂幼虫的级型决定和社会功能的分化(Schmitzova et al.，1998;Garcia et al.，2009);另外，mrjp2 也在蜜蜂脑部(Kucharski and Maleszka，2002;Albert and Klaudiny，2004;Garcia et al.，2009;Peixoto et al.，2009)和覃形体(Kucharski and Maleszka，2002;Hojo et al.，2010)中表达，但目前尚不了解它们在这些组织表达的具体生理功能。体外实验研究表明MRJP2 能刺激小鼠巨噬细胞释放TNF-a 因子，发挥抗肿瘤的作用(Simuth et al.，2004)，MRJP2 及其糖基化产物还具有抑菌作用等多种功能(Simuth，2001;Bíliková et al.，2009)。

mrjp3 在蜜蜂体内的表达较广泛，该基因在三型蜂中均发生表达，在哺育蜂体内的表达较采集蜂显著增高(Klaudiny et al.，1994b;Ohashi et al.，1997;Schmitzova et al.，1998;Drapeau et al.，2006;Liu and Su，2011);就具体部位而言除在王浆腺中大量表达外，该基因在蜜蜂的脑部、覃形体(Kucharski et al.，1998)和神经纤维网(Peixoto et al.，2009)中也有表达，这暗示着它在蜜蜂体内有多种生物学功能。MRJP3 的C-端存在一个数目可变的串联重复序列(Albert et al.，1999b)，此序列可能与与其它蛋白之间发生互作，进而影响蜂王后代的产浆量(Baitala et al.，2010);其次，当王浆中MRJP3 两种异构体68 kDa和64 kDa 之间的比例增大时，食用此种王浆的幼虫或蛹会出现体重增加、体型变大、发育周期缩短，以及蜂王的产卵力提高等现象(Huang et al.，2012)。并通过进一步比较MRJP3 与MRJP1 对蜂王幼虫发育的影响(Masaki，2011)，发现MRJP1维持蜂王幼虫的基本生长而MRJP3 能够优化蜂王幼虫生长。另有研究证实MRJP3 具有抗炎、抗过敏、发挥免疫调节等多种生物学活性(Takenaka，1984;Oka et al.，2001;Okamoto et al.，2003;Kohno et al.，2004)。

mrjp4 主要在哺育蜂王浆腺中表达，但其表达较其他王浆蛋白低(Klaudiny et al.，1994b;Kubo et al.，1996;Ohashi et al.，1997)，在采集蜂体内的表达显著低于哺育蜂(Liu and Su，2011)。蜂王体内mrjp4 仅在蜂王幼虫期进行表达(Chen et al.，2012)。由于该蛋白必需氨基酸含量较低，研究者认为mrjp4 在蜜蜂体内除营养功能外还可能发挥着其它的功能(Schmitzova et al.，1998)。

mrjp5 在蜜蜂各发育时期均有表达，在成虫期的表达量高于胚胎期、幼虫期和蛹期。在5 日龄及其之后的工蜂体内高丰度表达，至26 日龄左右时表达量显著降低(Drapeau et al.，2006)，该表达模式与 mrjp1 完全不同(Kucharski et al.，1998)。这说明尽管mrjps 各成员在基因组中的位置邻近，但它们的表达没有共同的调控机制。功能研究仅发现MRJP5 促进细胞的生长繁殖(刘芳等，2011)。

mrjp6 在蜜蜂体内的表达呈现出显著的级型差异。该基因在蜂王的幼虫期不发生表达(Chen et al.，2012)，而在工蜂的不同发育时期(包括幼虫期)均进行低丰度的表达，但在采集蜂中表达量高于哺育蜂(Liu and Su，2011)。有关该基因的功能目前报道较少，除了营养功能外的其它生物学作用尚未可知。

mrjp7 Chen 等(2012)通过对蜂王和工蜂的转录组研究，发现mrjp7 在蜜蜂的两个级型中都有表达，其表达具有时期特异性，mrjp7 仅在5 日龄的幼虫中表达而在4 日龄以内的幼虫中不发生表达;Liu 等(2011)和Garcia 等(2009)分别通过对哺育蜂和采集蜂头部的转录组测序和蛋白质组比较，发现mrjp7 在各阶段成年工蜂头部有表达，在哺育蜂中的表达量显著高于采集蜂;Hojo 等(2010)发现mrjp7是在蜜蜂头部覃形体中表达丰度最高的一种王浆主蛋白;Thompson 等(2006)通过比较产卵工蜂和正常工蜂头部和腹部的基因表达谱，鉴定出了三个表达显著差异的基因，mrjp7 就是其中之一，并证实了其在产卵工蜂头部的表达水平显著的低于正常工蜂。据此推断该基因可能调节工蜂卵巢的激活与否，从而决定工蜂的产卵特性。

mrjp8 Peiren 等(2008)通过对蜜蜂毒腺的蛋白质组分析发现，mrjp8 在毒腺中有表达，且会被分泌到毒囊中。后来Blank 等(2012)发现MRJP8 能够使蜂毒过敏者的体内产生lgE，说明MRJP8 在蜂毒中是一种过敏原，参与蜂毒引起的过敏反应。

mrjp9是mrjps 家族中不具有营养功能的王浆蛋白，该基因与熊蜂的BtRJPL 基因有较近亲源性，因此被认为可能是BtRJPL 基因的功能同系物(Kupke et al.，2008)。该基因在蜜蜂体内的表达水平普遍较低，在工蜂的王浆腺、毒腺、触角和蜂王的受精囊中均有表达(李江红等，2011)。目前一般认为MRJP9是作为一种过敏原参与蜂毒引起的过敏反应(Albert and Klaudiny，2007;Peiren et al.，2008)，或是作为表皮结构成分保护分泌细胞免于蜜蜂毒素引发的损伤(Peiren et al.，2005)。

5 结语

自上世纪九十年代以来，王浆主蛋白的研究一直是蜂学研究的热点，mrjps 家族各成员不断得到补充，该家族的起源进化、各成员的理化特征、表达调控和生物学功能等研究不断深入，初步搭建起了该家族的结构与生物学功能的基础。但仍有许多工作还不清楚，如此基因家族各成员进化关系，它们在蜜蜂体内的基因表达及调控方法和路径，各成员在蜜蜂体内的功能等等。研究者们还需的出更多的努力，挖掘蜜蜂王浆蛋白家族背后的生物学知识及其相关功能，以便更好的了解和利用这一重要蜜蜂资源。

References)

Albert S，Klaudiny J，Simuth J，1996.Newly discovered features of the updated sequence of royal jelly protein RJP57-1:Longer repetitive region on C-terminus and homology to Drosophila melanogaster yellow protein.J.Apicul.Res.，35:63-68.

Albert S，Bhattacharya D，Klaudiny J，Schmitzova J，Simuth J，1999a.The family of major royal jelly proteins and its evolution.J.Mol.Evol.，49:290-297.

Albert S，Klaudiny J，Simuth J，1999b.Molecular characterization of MRJP3，highly polymorphic protein of honeybee(Apis mellifera)royal jelly.Insect Biochem.Mol.Biol.，29(5):427-434.

Albert S，Klaudiny J，2004.The MRJP/YELLOW protein family of Apis mellifera:Identification of new members in the EST library.J.Insect Physiol.，50(1):51-59.

Albert S，Klaudiny J，2007.MRJP9，an ancient protein of the honeybee MRJP family with non-nutritional function.J.Apicul Res.，46(2):99-104.

Albertov V，Su SK，Brockmann A，Gadau J，Albert S，2005.Organization and potential function of the mrjp3 locus in four honeybee species.J.Agr.Food Chem.，53(20):8075-8081.

Baitala TV，Faquinello P，Toledo VAA，Mangolin CA，Martins EN，Ruvolo-Takasusuki MCC，2010.Potential use of major royal jelly proteins(MRJPs)as molecular markers for royal jelly production in Africanized honeybee colonies.Apidologie，41:160-168.

Bíliková K，Hanes J，Nordhoff E，Saenger W，Klaudiny J，Šimúth J，2002.Apisimin，a new serine-valine-rich peptide from honeybee(Apis mellifera L.)royal jelly:purification and molecular characterization.FEBS Lett.，528:125-129.

Bíliková K，Mirgorodskaya E，Bukovská G，Gobom J，Lehrach H，Šimúth J，2009.Towards functional proteomics of minority component of honeybee royal jelly:the effect of post-translational modifications on the antimicrobial activity of apalbumin2.Proteomics.，9:2131-2138.

Blank S，Bantleon FI，McIntyre M，Ollert M，Spillner E，2012.The major royal jelly proteins 8 and 9(Api m 11)are glycosylated components of Apis mellifera venom with allergenic potential beyond carbohydrate-based reactivity.Clin.Exp.Allergy.，42:976-985.

Chen X，Hu Y，Zheng H，Cao L，Niu D，Du Y，Sun Y，Hu S，Hu F，2012.Transcriptome comparison between honey bee queen-and worker-destined larvae.Insect Biochem.Mol.Biol.，42:665-673.

Drapeau MD，Albert S，Kucharski R，Prusko C，Maleszka R，2006.Evolution of the Yellow/Major Royal Jelly Protein family and the emergence of social behavior in honey bees.Genome Res.，16(11):1385-1394.

Fujita T，Kozuka-Hata H，Ao-Kondo H，Kunieda T，Oyama M，Kubo T，2013.Proteomic analysis of the royal jelly and characterization of the functions of its derivation glands in the honeybee.J.Proteome Res.，12(1):404-11.

Garcia L，Carlos H，Garcia S，Calabria LK，Cruz CN，Puentes AS，Bao SN，Fontes W，Ricart CAO，Espindola FS，Sousa MV，2009.Proteomic analysis of honeybee brain upon ontogenetic and behavioral development.J.Proteome Res.，8:1464-1473.

Gontarski H，1949.Uber die Vertikalorientierung der Bienen beim Bau der Waben und bei der Anlage des Brutnestes.Z.Verg.Physiol.，31:652-670.

Halberstadt K，1970.Ein Beitrag zur Ultrastruktur und zum Funktionszyklus der Pharynxdruse der Honigbiene(Apis mellifera L.).Cytobiology.，2:341-358.

Halberstadt K，1980.Elektrophoretische Untersuchungen zur Sekretionsta tigkeit der Hypopharynxdru¨ se der Honigbiene(Apis mellifera L.).Insect.Soc.，27:61-77.

Hanes J，Simuth J，1992.Identification and partial characterization of the major royal jelly protein of the honey bee(Apis mellifera L.).J.Apicul Res.，31:22-26.

Hojo M，Kagami T，Sasaki T，Nakamura J and Sasaki M，2010.Reduced expression of major royal jelly protein 1 gene in the mushroom bodies of worker honeybees with reduced learning ability.Apidologie，41:194-202.

Huang CY，Chi LL，Huang WJ，Chen YW，Chen WJ，Kuo YC，Yuan CM，Chen CN，2012.Growth stimulating effect on queen bee larvae of histone deacetylase inhibitors.J.Agricul.Food Chem.，60:6139-6149.

Kamakura M，Suenobu N，Fukushima M，2001.Fifty-seven-kDa protein in royal jelly enhances proliferation of primary cultured rat hepatocytes and increases albumin production in the absence of serum.Biochem.Biophy.Res.Co.，282(4):865-874.

Kanmkura M，Nobu M，Toshiyuki F，Makoto F，2001.Antifafigue effect of fresh royal jelly in mice.J.Nutr.Sci.Vitaminol.，47(6):394-401.

Kimura M，Kimura Y，Tsumura K，Okihara K，Sugimoto H，Yamada H，Yonekura M，2003.350-kDa royal jelly glycoprotein(apisin)，which stimulates proliferation of human monocytes，bears the beta1-3galactosylated N-glycan:analysis of the N-glycosylation site.Biosci.Biotech.Bioch.，67(9):2055-2058.

Klaudiny J，Hanes J，Kulifajova J，Albert S，Simuth J，1994a.Molecular cloning of two cDNAs from the head of the nurse honey bee(Apis mellifera L.)coding for related proteins of royal jelly.J.Apicul Res.，33:105-111.

Klaudiny J，Kulifajova J，Crailsheim K，Simuth J，1994b.New approach to the study of division of labor in the honeybee colony(Apis mellifera L.).Apidologie，25:596-600.

Knecht D，Kaatz HH，1990.Patterns of larval food production by hypopharyngeal glands in adult worker honey bees.Apidologie.，21:457-468.

Kohno K，Okamoto I，Sano O，Arai N，Iwaki K，Ikeda M，Kurimoto M，2004.Royal jelly inhibits the production of proinflammatory cytokines by activated macrophages.Biosci.Biotech.Bioch.，68(1):138-145.

Kramer KJ，Tager HS，Childs CN，1980.Insulinlike and glucagon-like peptides in insect hemolymph.Insect Biochem.，10:179-182.

Kramer KJ，Kramer KJ，Childs CN，Spiers RD，Jacobs RM，1982.Purification of insulin-like peptides from insect haemolymph and royal jelly.Insect Biochem.，12:91-98.

Kratky E，1931.Morphologie und physiologie der Dru¨sen im Kopf und Thorax der Honigbiene.Z.Wiss.Zool.，139:120-201.

Kubo T，Sasaki M，Nakamura J，Sasagawa H，Ohashi K，Takeuchi H，and Natori S，1996.Change in the expression of hypopharyngealgland proteins of the worker honeybees(Apis mellifera L.)with age and/or role.J.Biochem.，119:291-295.

Kucharski R，Maleszka R，Hayward DC，Ball EE，1998.A royal jelly protein is expressed in a subset of Kenyon cells in the mushroom bodies of the honey bee brain.Naturwissenschaften.，85(7):343-346.

Kucharski R，Maleszka R，2002.Evaluation of differential gene expression during behavioral development in the honeybee using microarrays and northern blots.Genome Biol.，3，RESEARCH0007.

Kupke J，Spaethe J，Mueller MJ，Rössler W，Albert S，2012.Molecular and biochemical characterization of the major royal jelly protein in bumblebees suggest a non-nutritive function.Insect Biochem.Mol.Bio.，42:647-654.

Lensky Y，Rakover Y，1983.Separate protein body compartments of the worker honeybee(Apis mellifera L.).Comp.Biochem.Phys.，75b:607-615.

Li J，Wang T，Zhang Z，Pan Y，2007.Proteomic analysis of royal jelly from three strains of western honeybees(Apis mellifera).J.Agr.Food Chem.，55(21):8411-8422.

Li JH，Liu Z，Ou YH，Peng WJ，Liang Q，2011.Construction and analysis of a cDNA library from queen honeybee spermatheca gland.Journal of Fujian Agriculture and Forestry University，40(4):384-391.［李江红，刘振，欧阳昊，彭文君，梁勤，2011.蜂王受精囊腺cDNA 文库的构建与分析.福建农林大学学报，40(4):384-391］

Liu F，Li WF，Li ZG，Zhang SW，Chen SL，Su SK，2011.High-abundance mRNAs in Apis mellifera:Comparison between nurses and foragers.J.Insect Physiol.，57:274-279.

Liu F，Su SK，2011.Structural analysis and function prediction of MRJP5 from Apis cerana cerana.Journal of Bee，5:1-4.［刘芳，苏松坤，2011.中华蜜蜂王浆蛋白MRJP5 的结构分析与功能预测.蜜蜂杂志，5:1-4］

Malecova B，Ramser J，O’Brien JK，Janitz M，Judova J，Lehrach H，Simuth J，2003.Honeybee(Apis mellifera L.)mrjp gene family:computational analysis of putative promoters and genomic structure of mrjp1，the gene coding for the most abundant protein of larval food.Gene，303:165-175.

Majtán J，Kováˇcová E，Bíliková K，Šimúth J，2006.The immunostimulatory effect of the recombinant apalbumin.Int.Immunopharmacol.，6(2):269-278.

Majtan J，Kumar P，Majtan T，Walls AF，Klaudiny J，2009.Effect of honey and its major royal jelly protein 1 on cytokine and MMP-9 mRNA transcripts in human keratinocytes.Exp.Dermatol.，19:73-79.

Masaki Kamakura，2011.Royalactin induces queen differentiation in honeybees.Nature，473:478-483.

Nakaoka T，Takeuchi H，Kubo T，2008.Laying workers in queenless honeybee(Apis mellifera L.)colonies have physiological states similar to that of nurse bees but opposite that of foragers.J.Insect Physiol.，54:806-812.

Ohashi K，Natori S，Kubo T，1997.Change in the mode of gene expression of the hypopharyngeal gland cells with an age-dependent role change of the worker honeybee Apis mellifera L.Eur.J.Biochem.，249，797-802.

Oka H，Emori Y，Kobayashi N，Hayashi Y，Nomoto K，200l.Suppression of allergic reactions by royal jelly in association with the restoration of macrophage function and the improvement of Th1/Th2 cell responses.Int.Immunopharmacol.，1(3):521-532.

Okamoto I，Taniguchi Y，Kunikata T，Kohno K，Iwaki K，Ikeda M，Kurimoto M，2003.Major royal jelly protein 3 modulates immune responses in vitro and in vivo.Life Sci.，73(6):2029-2045.

Otani H，Oyama M，Tokita F，1985.Polyacrylamide gel electrophoretic and immunochemical properties of proteins in royal jelly.Jap J.Dairy and Food Sci.，34:21-25.

Patel NG，Haydak M，Gochnauer TA，1960.Electrophoretic components of the proteins in honeybee larval food.Nature，186:633-634.

Peiren N，Vanrobaeys F，Graaf DC，Devreese B，Beeumen JV，Jacobs FJ，2005.The protein composition of honeybee venom reconsidered by a proteomic approach.BBA-Proteins.Proteom.，1752(1):1-5.

Peiren N，Graaf DC，Vanrobaeys F，Danneels EL，Devreese B，Beeumen JV，Jacobs FJ，2008.Proteomic analysis of the honey bee worker venom gland focusing on the mechanisms of protection against tissue damage.Toxicon，52:72-83.

Peixoto LG，Calábria LK，Garcia L，Capparelli FE，Goulart LR，Sousa MV，Espindola FS，2009.Identification of major royal jelly proteins in the brain of the honeybee Apis mellifera.J.Insect Physiol.，55:671-677.

Rembold H，1987.Die Kastenbildung bei der Honigbiene，Apis mellifica L.，aus biochemischer Sicht.In:Sozialpolymorphismus bei Insekten.Probleme der Kastenbildung im Tierreich.350-403，Schmidt G.H.(ed.)，Stuttgart:Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH.

Rosmilah M，Patel G，Lock J，Rahman D，Masita A，Noormalin A，2008.Characterization of major allergens of royal jelly Apis mellifera.Trop.Biomed.，25:243-251.

Sano O，Kunikata T，Kohno K，Iwaki K，Ikeda M，Kurimoto M，2004.Characterization of royal jelly proteins in both Africanized and European honeybees(Apis mellifera)by two-dimensional gel electrophoresis.J.Agr.Food Chem.，52(1):15-20.

Santos KS，Santos LD，Mendes MA，Souza BM，Malaspina O，Palma MS，2005.Profiling the proteome complement of the secretion fromhypopharyngeal gland of Africanized nurse-honeybees(Apis mellifera L.).Insect Biochem.Mol.Biol.，35(1):85-91.

Scarselli R，Donadio E，Giuffrida MG，Fortunato D，Conti A，Balestreri E，Felicioli R，Pinzauti M，Sabatini AG，Felicioli A，2005.Towards royal jelly proteome.Proteomics.，5(3):769-776.

Schmitzova J，Klaudiny J，Alberta S，Schroderb W，Schreckengostc W，Hanesa J，Judova J，Simutha J，1998.A family of major royal jelly proteins of the honeybee Apis mellifera L.Cell.Mol.Life Sci.，54(9):1020-1030.

Shen L，Zhang W，Jin F，Zhang L，Chen Z，Liu L，Parnell LD，Lai CQ，and Li D，2010.Expression of recombinant AccMRJP1 protein from royal jelly of Chinese honeybee in Pichia pastoris and its proliferation activity in an insect cell line.J.Agr.Food Chem.，58:9190-9197.

Simuth J，2001.Some properties of the main protein of honeybee(Apis mellifera L)royal jelly.Apidologie，32(1):69-80.

Simuth J，Bilikova K，Kovacova E，Kuzmova Z，Schroder W，2004.Immunochemical approach to detection of adulteration in honey:Physiologically active royal jelly protein stimulating TNF-alpha release is a regular component of honey.J.Agr.Food Chem.，52(8):2154-2158.

Su SK，Chen SL，Zhong BX，Albert S，2004.Cloning and sequence analysis of mrjp1 cDNA from Apis cerana cerana.Acta Genetica Sinica，31(11):1248-1253.［苏松坤，陈盛禄，钟伯雄，Albert S，2004.中华蜜蜂MRJP1 cDNA 的克隆及其序列分析.遗传学报，31(11):1248-1 253］

Su SK，Albert S，Chen SL，Zhong BX，2005.Molecular Clonging and analysis of four cDNAs from the heads of Apis cerana cerana nurse honeybees coding for major royal jelly proteins.Apidologie，36(3):389-401.

Takenaka T，Echigo T，1983.Proteins and peptides in royal jelly.Nippon.Nogeik.Kaishi.，57:1203-1209.

Takenaka T，1984.Studies on proteins and carboxylic acid in royal jelly.Bull.Fac.Agric.，Tamagawa Univ.，24:101-149.

Thrasyvoulou AT，1983.Native and dissociated protein patterns of larval food of honey bees(Apis mellifera cecropia L.).Apidologie，14:225-232.

Tomoda G，Mstsuyama J，Shibanai A，Yazaki E，1974.Studies on protein in royal jelly.(I)Solvent fractionation of protein and amino acid composition of each fraction.Bull.Fac.Agric.Tamagawa Univ.，14:86-96.

Tomoda G，Matsuyama J，Matsuka M，1977.Studies on protein in royal jelly.(II).Fractionation on water soluble protein by DEAE-cellulose chromatography，gel filtration and disc electrophoresis.J.Apicul Res.，16:125-130.

Thompson GJ，Kucharski R，Maleszka R，and Oldroyd BP，2006.Towards a molecular definition of worker sterility:differential gene expression and reproductive plasticity in honey bees.Insect Mol.Biol.，15(5):637-644.

Yatsunami K，Miwa S，Echigo T，1987.Studies on proteins in royal jelly by SDS-polyacrylamide gel electroph-oresis.Bull.Fac.Agric.Tamagawa Univ.，27:31-33.