深低温冷冻-酶洗法制备兔组织工程气管支架的研究

李建忠，吴 凡，汪 健，金 岩，韩 勇，闫小龙，倪云峰，赵晋波，张志培，李小飞

各种原因如创伤、肿瘤等引起的长段气管(≥60mm)缺损，因吻合口张力过大不能直接缝合时［1］，需要用人工气管来修复，其中同种异体组织工程化气管因其在免疫排斥、材料来源等方面的优势逐渐成为气管重建外科的研究热点。同种异体组织工程化气管支架制备较为常用的去抗原方法有深低温冷冻法［2－3］和酶消化法［4－5］，但二者都有自身的缺陷。气管的免疫原性主要来自于黏膜上皮细胞的细胞膜和细胞核，而深低温冷冻法不能有效地去除气管黏膜上皮细胞。细胞外基质有利于组织工程气管的再细胞化，酶消化法能够有效去除气管黏膜上皮细胞，同时去除了细胞外基质，不利于再细胞化。本实验探讨深低温冷冻-酶洗法处理后的气管支架在生物力学、去除黏膜上皮细胞及气管细胞基质保持方面，与深低温冷冻法和酶消化法有无差别。

材料与方法

1 实验材料

健康新西兰白兔购自中国人民解放军第四军医大学实验动物中心，脱氧胆酸钠购自北京奥博星生物技术有限责任公司，脱氧核糖核酸酶-Ⅰ(DNase-Ⅰ)购自德国Roche公司，两性霉素B购自美国Amresco公司。蔡司正置显微镜Axioskop 40购自德国ZEISS公司，钨灯丝扫描电镜VEGA3 LMH购自捷克Tescan公司，电子实验机购自日本Shimadzu公司。

2 实验方法

2.1 实验动物分组 健康新西兰兔24只，雌雄不限，体重2.5～3.0kg。将其随机等分为4组，每组6只。A组是对照组，行新鲜气管检测;B、C、D是实验组，分别进行深低温冷冻法、酶洗法、深低温冷冻－酶洗法处理。

2.2 气管支架的制备 深低温冷冻法［2－3］制备B组气管支架:耳缘静脉空气栓塞致死，无菌条件下取出气管，迅速剥离气管上的疏松结缔组织。经生理盐水冲洗，并在20万U/L青霉素、200mg/L庆大霉素溶液中浸泡3min后，将气管放入无菌生物袋中，然后将气管浸泡于冷冻保护液中，置于4℃冰箱冷平衡20min，再于程序降温仪的冷冻箱中程序降温，降温速率－1℃/min，至－80℃后投入－196℃液氮冷冻6～8周。检测前将冷冻袋从液氮中取出，置于37℃恒温水浴箱内，轻轻摇动，使气管段均匀快速解冻复温。

酶洗法［4－5］制备C组气管支架:无菌条件下迅速剥离气管的疏松结缔组织，然后将气管在含有1%青霉素、1%两性霉素B的磷酸缓冲液(PBS)中冲洗3min，置入4℃纯净水中浸泡48h后，将气管在含有4%去氧胆酸钠生理盐水中浸泡3h，然后在含有DNase-I 2 000KU/L的生理盐水中浸泡3h，如此循环3个周期，然后浸泡在4℃的PBS溶液中准备检测。

深低温冷冻-酶洗法制备D组气管支架:气管支架前期处理同B组气管支架，至－80℃后投入－196℃液氮冷冻6周。冷冻后将气管在含有4%去氧胆酸钠生理盐水中浸泡3h，再在含有DNase-I 2 000KU/L的生理盐水中浸泡3h，然后浸泡在4℃的PBS溶液中准备检测。

3 生物学检测

用直尺测量A、B、C、D组气管的长度;参照Macchiarini等生物力学检测标准［5］，将A、B、C、D组制备好的气管支架固定在电子实验机上，测出最大拉伸力、破裂力、破裂点，并算出变异率。将处理后的气管在甲醛中浸泡24h，行脱水、浸蜡、石蜡包埋、切片处理后，HE染色，光镜观察。戊二醛固定A、B、C、D组气管支架，梯度脱水，然后用CO2超临界萃取，喷铂金5min，扫面电镜观察。

4 统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行统计分析，定量数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 组织学形态

A组气管黏膜上皮组织有大量完整的黏膜上皮细胞，成软骨细胞密集均匀分布于气管软骨，见图1a;B组气管黏膜上皮组织仍有完整黏膜上皮细胞，见图1b;C组气管黏膜上皮组织未见完整的黏膜上皮细胞，见图1c;D组气管黏膜上皮组织未见完整的黏膜上皮细胞，可见一些残存的细胞基质，见图1d。

图1 组织学观察:a.对照组未处理气管(HE×400);b.深低温冷冻法气管(HE×400);c.酶洗法处理期气管(HE×400);d.改良的深低温冷冻法气管(HE×400)

2 扫描电镜观察

A、B、D组气管黏膜上皮组织见丰富细胞外基质，未见胶原纤维，见图2a、b、d;C组气管黏膜上皮组织见胶原纤维，未见细胞外基质，见图2c。

图2 扫描电镜观察处理:a.对照组未处理气管(×3000);b.深低温冷冻法气管(×3000);c.酶洗法处理期气管(×3000);d.改良的深低温冷冻法气管(×3000)

3 生物力学检测

如表1示:各组气管长度均数基本相等，差异无统计学意义(P＞0.05)。组间两两比较显示，最大拉伸力、破裂力、变异率无统计学意义(P＞0.05)。

表1 气管支架生物力学比较(±s)

表1 气管支架生物力学比较(±s)

组别 气管长度 最大拉伸力(N) 破裂力(N) 破裂点(cm) 变异率(%)A 5.02±0.60 4.465±0.65 0.645±0.072 9.64±0.48202±8 B 4.98±0.57 4.425±0.55 0.535±0.082 9.48±0.50 198±10 C 4.96±0.58 4.375±0.45 0.525±0.064 9.58±0.52 197±9 D 5.10±0.61 4.405±0.30 0.540±0.042 9.86±0.46 200±12

讨 论

气管支架是构建组织工程气管的关键环节。理想的气管支架应满足以下条件:易弯曲成形，且不致塌陷;允许呼吸道上皮细胞沿管腔生长;引起的炎性反应最小，无致癌性［6－7］。同种异体气管支架被公认为组织工程气管理想的气管来源，但是其免疫排斥影响组织工程再细胞化和再血管化，必须通过适当的处理去除免疫原性，保持力学性能，保护细胞外基质。同种异体移植物引起的免疫反应，多由移植物细胞膜表面的抗原蛋白和细胞核所致，而宿主对特异性无细胞基质的炎症-免疫反应并不明显。气管黏膜上皮细胞是引起气管同种异体移植免疫排斥反应的主要细胞，而成软骨细胞基本无免疫原性，深低温冷冻法不能有效去除气管黏膜上皮细胞。Macchiarini等［5］运用酶洗法制备气管支架完成了世界首例同种异体组织工程气管移植，为气管重建指明了方向。然而，患者移植后9个月发生气管塌陷，这可能与骨髓间充质干细胞不能很好的再细胞化有关。本研究探讨深低温冷冻-酶洗法(将酶洗法和深低温冷冻法相结合)制备组织工程气管支架。

本实验将兔气管分别进行深低温冷冻法、酶洗法及深低温冷冻-酶洗法处理，组织学结果显示运用深低温冷冻-酶洗法制备的气管支架没有完整的黏膜上皮细胞，细胞核破碎。由此推断深低温冷冻-酶洗法能够去除气管支架免疫原性。同时还证实，深低温冷冻-酶洗法比酶洗法制备的气管支架有更多的细胞外基质。细胞外基质没有免疫原性，有助于再细胞化和再血管化，因此运用深低温冷冻-酶洗法比酶洗法获得的气管支架更有助于受体的气管黏膜上皮细胞和成软骨细胞存活，微血管生成，防止气管塌陷。在生物力学方面，深低温冷冻-酶洗法制备的气管支架与其他组差异无统计学意义。

综上所述，深低温冷冻-酶洗法制备的气管支架可能更适合制备组织工程气管，其实际效果有待于动物实验的进一步研究。

［1］Tojo T，Kitamura S，Gojo S，et al.Epithelial regeneration and preservation of tracheal cartilage after tracheal replacement with cryopreserved allograft in the rat［J］.Thorac Cardiovasc Stag，1998，116(4):624－627.

［2］闫小龙，李小飞，刘勇.深低温冷冻对rhBMP－2诱导犬气管移植体软骨再生的影响［J］.第四军医大学学报，2005，26(2):160－163.

［3］Autissier A，Le Visage CL，Pouzet C，et al.Fabrication of porous polysaccharide－based scaffolds using a combined freeze－drying/cross－linking process［J］.Acta Biomaterialia，2010，6(9):3640－3648.

［4］Go T，Jungebluth P，Baiguero S，et al.Both epithelial cells and mesenchymal stem cell－derived chondrocytes contribute to the survival of tissue－engineered airway transplants in pigs［J］.Thorac Cardiovasc Surg，2010，139(2):437－443.

［5］Macchiarini P，Jungebluth P，Go T，et al.Clinical transplantation of a tissue－engineered airway［J］.Lancet，2008，372(9655):2023－2030.

［6］Sato T，Nakamura T.Tissue－engineered airway replacement［J］.Lancet，2008，372(9655):2003－2004.

［7］Sato T，Araki M，Nakajima N，et al.Biodegradable polymer coating promotes the epithelization of tissue－engineered airway prostheses［J］.J Thorac Cardiovasc Surg，2010，139(1):26－31.