血浆miR-145在结直肠癌中的表达及临床意义

黄伟 张乐鸣 张怡 陈莹

血浆miR-145在结直肠癌中的表达及临床意义

黄伟 张乐鸣 张怡 陈莹

目的 研究miR-145在结直肠癌患者和健康者血浆中的表达差异，并探讨其与临床特征之间的关系。 方法 收集53例初治结直肠癌患者和26例健康者外周血浆，提取总RNA，用反转录及real-time PCR检测miR-145的表达情况，分析其与临床特征之间的关系，评估其对结直肠癌的诊断效能。 结果 miR-145在结直肠癌患者血浆中的表达较健康者显著降低（P＜0.01），miR-145的AUC为0.859，鉴别结直肠癌患者的敏感性86.8%、特异性88.5%，但miR-145的表达水平与临床特征（性别、年龄、肿瘤位置、淋巴结状态、TNM分期、局部浸润深度及CEA水平）之间均无相关性（均P＞0.05）。 结论 血浆miR-145有望作为结直肠癌的新型标记物，但可能只参与了结直肠癌发生的起始过程。

miRNA miR-145 结直肠癌 血浆

miRNA miR-145 Colorectal cancerPlasma

结直肠癌是人类常见的消化道恶性肿瘤。因其早期症状不典型，临床缺乏有效的早期筛查方法，而肠镜等侵入性检查又降低了患者的依从性，大多数患者确诊时已属中晚期。因此，需要建立一个简单、实用的早期筛查方法。MicroRNAs（miRNAs）是一类长约22个核苷酸，单链、内源性、高度保守的非编码小分子RNA[1]。多项研究结果[2-4]显示，miRNAs具有调控细胞发育、分化、增殖及凋亡等作用，并作为肿瘤性miRNAs（oncomiRs）或肿瘤抑制性miRNAs（ts-miRs）参与肿瘤的形成与演变，已被证实有潜力作为多种恶性肿瘤新型标记物。本研究采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）技术检测结直肠癌患者及健康体检者血浆中miR-145的表达水平，并分析与患者临床特征之间的关系，探讨其在结直肠癌患者中的临床意义。

1 资料和方法

1.1 一般资料 收集宁波市第一医院2011-08—11的53例结直肠癌患者的血浆标本。53例均为腺癌，其中结肠癌17例，直肠癌36例。女15例，男38例，年龄28～80岁，中位年龄58岁。淋巴结转移阳性者33例，阴性者20例。按照最新结直肠癌TNM分期，I期6例、Ⅱ期14例、Ⅲ期27例、Ⅳ期6例。另选取26例年龄、性别匹配的健康体检者作为正常对照组，血清CEA、CA19-9及腹部CT均未见异常，无肿瘤病史。所有入组患者手术前均未经过放疗及化疗，且无合并症。在采集标本前均征得本人同意，并签署知情同意书，按2009年由国际抗癌联盟（UICC）和美国肿瘤联合会（AJCC）联合制定的肠癌TNM分期法对结直肠癌病例进行病理学分型，以病理学诊断作为最终诊断。

1.2 标本处理和RNA提取 用EDTA管采集外周静脉血5ml，常温下4h内进行处理。血标本在4℃下1 200g离心10min，取上层血浆再在4℃下12 000g离心10min，再取上层血浆-80℃冰箱保存。总RNA提取：取-80℃冰箱保存的血浆标本400μl，采用美国Ambion公司生产的mirVana PARIS Kit，按说明书提取总RNA，用NanoDrop2000超微量分光光度计测定RNA浓度及OD260/ OD280比值，-80℃冰箱保存备用。

1.3 miRNA的cDNA合成 采用德国Qiagen公司生产的miScript Reverse Transcription Kit合成cDNA，反应条件为：37℃60min，95℃5min。反应结束后，合成的cDNA-20℃保存。

1.4 miRNA的荧光定量检测 采用德国Qiagen公司生产的miScript SYBR Green PCR Kit进行real-time PCR检测，所有反应采用2复孔。25μl的反应体系：2.5μl的 cDNA，12.5μl的 2×QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix，5.0μl的 RNase-free water，2.5μl的10×miScript Universal Primer，2.5μl的miRNAs特异前向引物，miR-145及U6的引物由上海捷瑞公司合成，miR-145引物序列为5′-GGCGTCCAGTTTTCCCAG-3′U6为5′-ACGCAAATTCGTGAAGCGTT-3′。反应条件为：95℃15min，接着94℃15s，55℃30s，70℃34s，45个循环。采用ABI step-one plus实时定量PCR仪进行检测，Ct值用SDS2.1软件计算。检测miRNA的相对表达定量时，以U6作为内参基因，采用2-△△Ct法进行结果分析，将不同样本的相对表达定量值（relative quantity，RQ）进行比较。RQ=2-△△Ct，△△Ct=待测标本的△Ct-对照样本△Ct，△Ct=目的基因Ct值-内参基因Ct值[5]。

1.5 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件，计量资料以表示，miRNAs相对表达量呈偏态分布、方差不齐，以中位数和四分位数间距表示；两组间或多组间比较采用Mann-Whitney U检验或Kruskall-Wallis检验；应用ROC曲线评价诊断效能。

2 结果

2.1 结直肠癌患者与健康体检者血浆中miR-145的表达 miR-145及U6的Realtime PCR扩增曲线均呈“S”型；PCR产物熔解曲线均为单峰，说明扩增的目的基因特异性好且结果可靠，见图1。

图1 Realtime PCR检测患者与健康体检查血浆中miR-145的表达（A：部分样本的U6及miR-145扩增曲线；B：U6熔解曲线；C：miR-145熔解曲线）

以U6为内参，结直肠癌患者血浆中miR-145的RQ为0.407（0.244，0.912）；健康体检者血浆中RQ为1.512（1.386，1.713）。采用非参数秩和检验，两者差异有统计学意义（P＜0.01），见图2。

2.2 血浆miR-145在结直肠癌中的诊断效能 根据ROC曲线分析，血浆miR-145的AUC为0.859（95%CI: 0.772～0.947），在最佳截断值1.0568，血浆miR-145的敏感性为86.8%，特异性为88.5%，见图3。

2.3 血浆miR-145的表达水平与结直肠癌患者临床特征之间的关系 血浆miR-145的RQ与结直肠癌患者的性别、年龄、肿瘤位置、淋巴结状态、TNM分期、局部浸润程度及血清CEA水平无相关性（均P＞0.05），见表1。但在不同TNM分期的患者血浆miR-145的RQ与健康对照组均有统计学差异（均P＜0.01），然而其表达量未显示出随着TNM分期的增加而降低的趋势，见图4。

3 讨论

提高癌症早期阶段的检出率能显著提高患者生存率，降低癌症病死率及延长患者生存时间。目前的新型早期筛查方法主要是对肿瘤标记物的寻找，标本主要是血液、尿液、胸腹水等体液，相比传统的组织标本来源更易获得，对患者的创伤更小。自从Mitchell等[2]首次证实血浆中miRNA能鉴别出前列腺癌患者后，循环miRNA作为新型肿瘤标记物成为研究的热点。最近，Allen等[6]研究发现血浆中miRNAs性质非常稳定，即便在100℃煮沸10min或室温下放置不同的时间（4、12、24h）或反复冻融，其表达水平基本不变，这为今后的研究奠定了基础。随后在乳腺癌[7]、胃癌[8]、胰腺癌[9]、肝癌[10]及肺癌[11]等恶性肿瘤患者的血浆中发现：miRNAs异常的表达与组织病理学特征以及疾病的不同阶段之间有着密切的关系。目前Slaby等[12]、Wang等[13]及龚等[14]研究结直肠癌组织与癌旁组织中miR-145的表达情况发现:miR-145在结直肠癌组织中均显著低表达（均P＜0.01），但表达水平是否与临床特征有关尚有争议，而结直肠癌患者血浆中miR-145的表达情况则缺乏相关研究；另外Wang等[13]报道：miR-143只在结肠癌中表达降低，考虑到本研究中大多数研究对象是直肠癌患者（36/53），故选择了miR-145来研究血浆miRNAs作为结直肠癌非侵入性标记物的价值。

图2 结直肠癌患者及健康体检者血浆中miR-145的RQ（图中数字代表该组数据中变异较大的标本）

图3 miR-145的ROC曲线

图4 不同TNM分期结直肠癌患者和健康体检者的血浆miR-145的RQ（图中数字代表该组数据中变异较大的标本）

表1 血浆miR-145的RQ与患者临床特征之间的关系

miR-145在鼠的心脏中首次被发现[15]，基因编码位于染色体5q32上，后Michael等[16]证实miR-145基因存在于人类同样染色体位置，但是人类染色体5q31是一个脆性位点，与染色体5q32相距很近，该位点基因突变或缺失容易导致miR-145的缺失或下调，这可能是导致腺瘤和结直肠癌组织中miR-145表达水平显著降低的原因之一。其他研究[17]发现，miR-145不仅在多种肿瘤组织中下调，还在多种肿瘤细胞株中下调，且对肿瘤细胞的扩增、侵袭及转移有抑制作用。但是miR-145在各种肿瘤患者的体液（包括血液、尿液、胸腹水、唾液等）中的研究仍然缺乏，这将是今后研究的新领域。本研究中，miR-145在结直肠癌患者血浆中表达量相比健康对照组显著降低，两者差异有统计学意义，但是其表达水平与临床特征如性别、年龄、肿瘤位置、淋巴结状态、肿瘤TNM分期、局部浸润深度及血清CEA水平均无相关性，这与Slaby等[12]和Wang等[13]报道miR-145的低表达水平与结直肠癌患者的临床特征之间无关相符合，提示miR-145可能仅在结直肠癌发生的起始阶段发挥作用，但矛盾的是龚文容等[14]报道miR-145的低表达水平与肿瘤的分化程度及远处转移或浸润生长密切相关。这可能与标本量小及标本来源的不同有关。另外有研究表明[18]miR-145对黏蛋白（Mucin-1）的作用减弱或消失将促进肿瘤的生长和转移。Gregersen等[19]研究发现miR-145能够通过识别YES基因和转录因子STAT1来发挥抑制肿瘤生长的功能。Sachdeva等[20]通过调节抑癌基因p53对miR-145的诱导来发挥对促癌基因c-Myc的抑制作用，从而抑制肿瘤的生长和浸润。上述研究结果表明miR-145可能通过突变、缺失、调节转录因子或致癌基因等机制来发挥肿瘤抑制性miRNAs（ts-miRs）的作用，但是具体机制还有待进一步研究。

粪便隐血试验、血清CEA检测及肠镜仍是目前临床上发现结直肠癌的常用手段，但肠镜属于侵入性操作，其他检查敏感性及特异性低[21]，致使临床上结直肠癌的早期检出率仍然偏低。本研究中ROC曲线分析发现：血浆miR-145的AUC为0.859（95%CI:0.772～0.947），鉴别结直肠癌患者的敏感性为 86.8%、特异性为88.5%，说明血浆miR-145对结直肠癌有较准确的诊断价值，相比肠镜、组织病理取材等侵入性检查具有创伤小、取材方便、患者依从性好等优势，有望用于结直肠癌的早期筛查和术后复发监测。如果进一步研究更大样本量的miR-145表达水平及临床意义，结合Ng等[3]和Huang等[4]发现的miR-92a和miR-29a，有望建立结直肠癌的miRNAs联合诊断模型，使血浆miRNAs成为结直肠癌常规临床诊断的非侵入性标记物。

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2012-08-30）

（本文编辑：胥昀）

315000 宁波大学医学院（黄伟，硕士研究生）；宁波市第一医院肿瘤外科（张乐鸣），重点实验室（张怡、陈莹）

张乐鸣，E-mail：zlm.nb@163.com

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the plasma expression of miR-145 in patients with colorectal cancer and its clinical significance. Methods The plasma levels of miR-145 in 53 patients with colorectal cancer and 26 healthy subjects were measured using real-time quantitative PCR.The relationship between miR-145 expression and clinical characteristics of colorectal cancer was analyzed.The diagnostic value of miR-145 for colorectal cancer was evaluated.Results The plasma miR-145 levels were decreased significantly in colorectal cancer patients（P＜0.01）.The AUC (the area under the ROC curve)of miR-145 was 0.859 with a 86.8%sensitivity and 88.5%specificity in discriminating colorectal cancer from normal subjects;however,the expression levels of miR-145 were not associated with the gender,age,tumor location,nodal status,TNM staging,T-classification and CEA levels of patients (P＞0.05). Conclusion A decreased plasma miR-145 levels are detected in patients with colorectal cancer,which suggests miR-145 might be used as a potential tumor-marker for colorectal cancer.