核磁共振内标法测定苏丹红I对照品的含量

耿岩玲，马然，刘伟，高红梅，刘建华，王晓，段文娟*

(1.山东省科学院中药过程控制研究中心，山东省分析测试中心，山东 济南 250014;2.山东师范大学生命科学学院，山东 济南 250014)

苏丹红是一种人工合成的红色染料，常作为工业染料广泛应用于石油、机油和其他的一些工业溶剂中，目的是增色，也可用于鞋、地板等的增光。苏丹红有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ号4种，该类物质具有偶氮结构，毒理学研究表明其具有致突变性和致癌性，在我国和世界上许多国家都禁止用于食品中。但由于具有良好的光泽持久性与稳定性，不法商贩将其用于改善食品的感官色泽。近年来，苏丹红色素，特别是苏丹红I，经常被添加到辣椒及相关食品、熟食和口红中，对人类健康的危害非常大［1－2］。目前苏丹红I的含量测定方法主要有液相色谱法、薄层色谱法、色质联用法等［3－5］，虽然采用色谱法进行含量测定在分离上具有一定的优势，但是由于残留的溶剂、无机物等杂质与被测物质色谱响应值不同，造成了样品的绝对含量测定结果不准确。而且，采用以上方法测定含量均需要对照品。

早在20世纪70年代，就有关于核磁共振定量分析的报道。随着超导高磁场的脉冲Fourier变换核磁共振谱仪的应用，核磁共振定量分析方法在准确度、灵敏度及分析速度等方面都得到了极大的提高，已经接近HPLC的水平，而且这种分析法具有所需样品量少、扫描时间短以及无需标准品等优点［6］。核磁共振定量分析法用于样品的含量测定已有文献报道，美、英等国和地区的药典中也先后引入了此方法［7－10］，但是有关采用此方法进行苏丹红含量测定的研究未见报道。本研究采用核磁共振内标法对苏丹红I对照品的含量进行测定，以期建立在没有对照品的情况下苏丹红I的含量测定和质量控制方法，并为其他化学对照品含量的测定方法提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器

Varin Inova 600mHz超导核磁共振波谱仪(美国 Varian公司)。

1.2 试剂

氘代氯仿 (美国CIL公司，氘代度＞99.9%)，苯甲酸(美国Sigma公司，批号101253928，纯度99.2%)，苏丹红I对照品(山东省分析测试中心研制)。苏丹红I和苯甲酸的结构见图1。

图1 苏丹红I和苯甲酸的化学结构式Fig.1 Chemical structure of Sudan I and benzoic acid

1.3 实验条件

测定温度:25 ℃，FT size:131072，谱宽:15000.9 Hz，环境湿度:35%，观察频率:599.773 MHz，采集时间:3.000 s，累加次数:32。

1.4 实验方法

根据文献报道［11］，分别精密称取适量苏丹红I对照品和苯甲酸对照品，置于直径5 mm的核磁共振样品管中，加适量氘代氯仿试剂振荡溶解，制成待测试样溶液。在上述实验条件下调整仪器参数，匀场、采样，得到图谱后再进行相位和基线调整，对苏丹红I和苯甲酸的定量峰分别进行积分，按照1H-NMR内标法根据积分结果用以下公式计算样品的质量分数。

上述公式中，As:被测样品定量峰的积分面积，ns:被测样品定量峰包含的质子数，Ms:被测样品的分子质量，Ar:内标物质定量峰的积分面积，nr:内标物质定量峰包含的质子数，Mr:内标物质的分子质量，mr:称取的内标质量，Wr:内标的质量分数，ms:样品的质量。

2 结果与讨论

2.1 溶剂、内标和定量特征峰的选择

测试溶剂应选择对被测样品和内标物溶解性都非常好且不造成干扰的氘代试剂。本研究选择氘代氯仿为测试溶剂，该溶剂对苏丹红I和苯甲酸的溶解性都很好，且核磁共振氢谱上的溶剂峰在δ 7.26，对其他信号峰无干扰，不会影响含量测定结果。选择苯甲酸为内标物，从苯甲酸的核磁共振氢谱中可以看到苯甲酸的2位和6质子信号在δ 8.13，与其他信号完全分开，因此，可作为内标物。

在定量分析之前，已经通过核磁共振一维谱和二维谱对目标化合物的信号进行了全归属。在苏丹红I的核磁共振氢谱上可以看到，5位的质子信号化学位移在δ 8.51，与其他信号完全分开，因此，可作为定量分析的特征峰。核磁共振氢谱法测定苏丹红I含量的图谱见图2。

图2 核磁共振氢谱法测定苏丹红I含量的图谱Fig.2 1H-NMR spectrum of sudan I content determination

2.2 线性关系

按1.4的实验方法制备6个不同浓度的样品溶液，测定1H-NMR谱，分别对苏丹红I和苯甲酸特征信号峰的峰面积进行积分，每个样品的积分面积取3次积分的平均值，结果见表1。

表1 苏丹红I与苯甲酸的质量及峰面积积分值Table 1 Mass and integral value of peak area of Sudan I and benzoic acid

以苏丹红I和苯甲酸的积分面积比值y对苏丹红I和苯甲酸质量比值x做线性关系图，得回归方程为y=0.2424x－0.0028，相关系数r=0.9982。结果表明，采用核磁共振内标法对苏丹红I的含量进行测定，线性关系良好。

2.3 重复性实验

取2.2的2号样品，在上述同一实验条件下重复测定6次，以苏丹红I和苯甲酸定量特征峰的积分面积比值计算，检测重复性，RSD值为0.53%，结果表明，此方法重复性良好。

2.4 稳定性实验

取2.2的 2号样品，室温下放置，按1.4的实验方法，分别于 0、4、6、8、10 h后测定，检测稳定性，RSD 值为0.656%，实验结果表明，样品溶液在10 h内稳定。

2.5 加样回收率实验

分别取6份已知含量的苏丹红I样品约5 mg，精密称定，分别加入高、中、低3个浓度的苏丹红I标准品，按1.4的实验方法测定1H-NMR谱，按回收率(%)=［测得含量－样品含量］/标准品添加，计算回收率，所得结果见表2。

表2 加样回收率实验(n=6)Table 2 Experiment of the average recovery rate(n=6)

2.6 样品测定

按照上述实验条件和方法，测定3批苏丹红I对照品和苯甲酸特征峰的峰面积，根据1.4的计算公式计算出苏丹红I对照品的绝对质量分数，同时采用高效液相色谱(HPLC)法对此3批苏丹红I对照品的相对质量分数进行测定，结果见表3。由表3中可以看到，采用核磁共振波谱法测得苏丹红I对照品的质量分数略低于HPLC峰面积归一化法。

表3 3批苏丹红I对照品含量测定结果(质量分数/%)Table 3 Determination result of the content of 3 batches of Sudan I

2.7 扫描次数的选择

将扫描次数设定为4、8、16、32、64、128，对样品分别进行实验。结果表明，扫描次数越多，信号信噪比越好，但是扫描次数的改变对样品和内标物积分面积的比值没有明显的影响，因此选择扫描次数为32。

3 结论

实验结果表明，采用核磁共振波谱法对苏丹红I含量进行测定，线性关系、重复性和稳定性均良好。此方法具有样品量小、高效、简便、无需对照品等优点，含量测定和结构鉴定可同步完成，可以用于其他化学对照品含量的测定。

［1］秦菲.食品中苏丹红的毒性及检测方法［J］.北京联合大学学报:自然科学版，2008，22(2):50－54.

［2］张满芳，王向红，黄桂湘，等.苏丹红色素概述及苏丹红色素的检验［J］.使用预防医学，2008，15(4):1251－1252.

［3］洪祥奇，张扬.薄层色谱测定食品中苏丹红染料方法的探讨［J］.中国卫生检验杂志，2006，16(11):330－332.

［4］GB/T 19681－2005，食品中苏丹红染料的检测方法高效液相色谱法［S］.

［5］CALBIANI F，GARERI M，ELCIRI L，et al.Accurate mass measurements for the confirmation of Sudan azo-dyes in hot chilli products by capillary liquid chromatography-electro-spray tandem quadrupole orthogonal-acceleration time of flight mass spectrometry［J］.J Chromatogr A，2004，1058(1/2):127－135.

［6］张友杰，刘小鹏.药物核磁共振定量分析参数的研究［J］.波谱学杂志，2007，24(3):289－295.

［7］于小波，相秉任，王国华，等.核磁共振法测定硫酸依替米星含量［J］.中国抗生素杂志，2011，36(8):610－612.

［8］United States Pharmacopoeia Commission.United States Pharmacopoeia［M］.US:US Pharmacopoeia Convention，Inc.，2000:1221－1222.

［9］杨金霞，姚婷玉，王建伟，等.核磁共振法测定西洛他唑含量［J］.化学分析计量，2012，21(4):68－70.

［10］易进海，刘云华，陈燕，等.核磁共振波谱法测定蒿本内酯对照品的含量［J］.药物分析杂志，2010，30(4):680－682.

［11］蒋文，苏敏，陈双全，等.核磁共振氢谱内标法测定茚地普隆的含量［J］.分析化学研究简报，2008，36(3):385－388.