‘琯溪蜜柚’贮藏期间汁胞粒化与木质素代谢的关系

潘腾飞 朱学亮等

摘 要： 【目的】为了探讨‘琯溪蜜柚贮藏过程中汁胞粒化与木质素的关系，以及外源激素对木质素合成与汁胞粒化的影响，【方法】以‘琯溪蜜柚果实为材料，利用水杨酸（SA）处理低温贮藏的‘琯溪蜜柚果实，测定了贮藏过程中汁胞粒化指数、木质素含量以及木质素合成途径中关键酶的活性。【结果】结果表明，汁胞粒化指数、木质素含量、木质素合成关键酶的活性在整个贮藏过程中逐渐升高，SA处理的木质素合成的关键酶PAL、CAD和POD的活性均显著低于对照，木质素含量和粒化指数也显著低于对照。木质素含量与粒化指数的相关系数为0.943，木质素合成酶的活性与木质素含量的相关系数为0.981。【结论】研究认为，‘琯溪蜜柚采后贮藏期间汁胞粒化程度与汁胞中木质素含量为正相关的关系，适宜浓度的SA对汁胞粒化的抑制作用主要是通过抑制木质素合成途径中关键酶的活性，减少木质素的合成，从而减轻汁胞粒化的程度。

关键词： ‘琯溪蜜柚； 汁胞粒化； 水杨酸； 木质素

中图分类号：S666.3 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2013？雪02-0294-05

汁胞粒化是柑橘类果树常见的一种生理现象。‘琯溪蜜柚[Citrus grandis （L.） Osbeck ‘Guanximiyou]的汁胞粒化是成熟后期和采后贮藏期间发生的生理病害，其主要表现为汁胞异常膨大、变硬，有汁胞木质化，汁味变淡，造成果实食用品质下降，甚至丧失商品价值，给果农带来很大的经济损失。潘东明等[1]研究发现‘琯溪蜜柚汁胞在粒化过程中伴随着细胞壁加厚，纤维、半纤维增多，高尔基体增加，核体积增大，并且粒化汁胞会出现多核仁现象。木质素是由木质素单体经氧化耦合形成的化合物，其氧化过程主要发生在次生加厚的细胞壁[2-3]。Ilan等[4]观察到柚汁胞粒化与汁胞细胞的木质化有直接关系，但与汁胞中木质素合成的关系尚未明确。

木质素单体的合成主要经过苯丙酸途径进行，包括了子系列的酶促反应和羟基化、甲基化及还原反应，最终生成3种单体物质[2]，合成的木质素单体被过氧化物酶或者漆酶氧化成木质素[3， 5-6]。木质素生物合成途径的关键酶包括苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂醇脱氢酶（CAD）和过氧化物酶（POD）等[7]。在枇杷中的研究发现，水杨酸（salicylic acid，SA）能抑制低温贮藏过程中PAL、CAD和POD的活性[8]。潘东明等[9]研究表明KT、2，4-D、NAA等能抑制汁胞粒化的发生和发展，但未见SA抑制柚汁胞粒化发生的报道，且SA与木质素合成的关系尚不明确。我们拟用SA处理成熟的‘琯溪蜜柚果实，探讨在贮藏过程中，木质素的合成与汁胞粒化的关系，以及外源激素SA如何影响木质素的合成与汁胞粒化的发生。

1 材料和方法

1.1 材料

供试材料采自福建省漳州市平和县新桥镇小溪村大坑果园内1株30 a树龄的‘琯溪蜜柚树，于成熟期采果，每个处理60个果，采收后立即送至实验室。预冷的‘琯溪蜜柚果实分别采用0.5 g·L-1（SA1）、1.0 g·L-1（SA2）和1.5 g·L-1（SA3）水杨酸（SA）浸果60 min处理，然后晾干，装入保鲜袋；以不浸泡处理为对照，均置于7 ℃下贮藏。贮藏过程中每20 d取出部分果实用于试验，各处理均设置3次重复。

观察‘琯溪蜜柚果的粒化情况，记录粒化指数，并从中随机取粒化和未粒化的汁胞用于木质素含量和相关酶活性的测定。

1.2 方法

1.2.1 ‘琯溪蜜柚粒化指数的统计 果实粒化程度用粒化指数表示，按照潘东明等[1]的方法统计。

1.2.2 汁胞木质素含量的测定 参照鞠志国[10]的方法，取3.5 g汁胞加入10 mL沸水，冷却后加入86% H2SO4 25 mL，室温下充分搅拌水解4 h，后加入蒸馏水250 mL，加热煮沸1 h，冷却后用预先烘干至恒质量的G4砂心漏斗抽滤，再用蒸馏水洗涤，洗涤液用10% BaCl2检查，以不出现BaSO4沉淀为止，G4砂心漏斗烘干后称重。

1.2.3 汁胞PAL活性的测定 参照Cheng等[11]的方法，并略作修改。

PAL的提取： 取1 g汁胞于研钵中，并加入少量的提取介质，冰浴研磨成匀浆，搅匀，10 000 ×g离心15 min。上清液即为待测酶液。

PAL的测定： 反应体系含1.0 mL酶液、0.02 mol·L-1的L-苯丙氨酸1.0 mL和0.05 mol·L-1 pH 8.8硼酸缓冲液2 mL，总体积为4.0 mL。反应液于290 nm测其吸光值，以反应液1 h变化0.001吸光值为1个酶活性单位，PAL活性以U·g-1 FW表示，重复测定3次。

1.2.4 汁胞CAD 活性的测定 参照Goffner等[12]的方法。反应液含有0.2 mL酶提取液，6.4 mmol·L-1的NADP 1.25 mL， 3.2 mmol·L-1的松柏醇1.25 mL，pH 6.5磷酸缓冲液1.3 mL，总体积4.0 mL。于340 nm处测定其吸光值，以1 min变化0.001吸光值为1个酶活性单位，CAD活性以U·g-1 FW表示，测定3次重复。

1.2.5 汁胞 POD活性的测定 参照Meloni等[13]的方法测定。

酶液提取： 称取汁胞样品1 g，加入5 mL 50 mmol·L-1 pH 7.0 PBS（含10%PVP），冰浴研磨，于15 000×g低温4 ℃离心20 min，取上清液供POD测定用。每个样品重复3次。

POD活性测定： 参照Meloni等[13]的方法。反应混合液由0.2 mol·L-1 PBS （pH 6.0） 50 mL、H2O2 （30%） 0.028 mL和愈创木酚0.019 mL混合而成。测定时取10 μL酶液加反应混合液3 mL混匀，参比为50 mmol·L-1 pH 7.0 PBS 10 μL加反应混合液3 mL混匀，测定A470值，静置5 min后，再测A470的值，并计算差值。POD活性以ΔA470 ·min-1·g-1表示（鲜质量计）。

POD活性按下式计算：

POD活性=（ΔA470 VT）/（0.01WF·V1·T）

以每分钟ΔA470变化0.01为1个POD活性单位（U）。VT表示提取液总体积（mL）；V1表示测定时用去酶液体积（mL）；T表示反应时间（min）。

2 结果与分析

2.1 ‘琯溪蜜柚贮藏期间粒化指数的统计

在贮藏过程中，各处理的汁胞粒化指数均随着贮藏期的延长而逐渐上升（图1）。在贮藏40 d前，对照组和0.5 g·L-1 SA处理的粒化指数显著上升，而1.0 g·L-1和0.5 g·L-1 SA处理的汁胞粒化指数无显著差异，贮藏40 d后，汁胞粒化指数显著升高，不同浓度SA处理的柚果汁胞粒化指数均显著低于对照，其中1.0 g·L-1 SA处理能较好地减少汁胞粒化的发生。

2.2 ‘琯溪蜜柚贮藏期间汁胞木质素含量的变化

对照处理和SA处理的‘琯溪蜜柚在贮藏40 d后汁胞木质素的含量均显著升高。在采后贮藏40 d至60 d期间，各处理的木质素含量急剧增加，但SA处理能显著减缓蜜柚汁胞木质素含量的升高，其中1.0 g·L-1 SA处理的效果最显著（图2）。结果表明，贮藏期间随着木质素的积累，汁胞木质化程度随之升高，木质素含量的增加与粒化指数的变化呈显著正相关，相关系数为0.943，说明汁胞粒化可能是由木质素累积到一定量后引起的生理变化，SA能减少木质素的合成，降低粒化指数。

2.3 ‘琯溪蜜柚贮藏期间木质素合成相关酶活性的测定

图3表明，各处理的‘琯溪蜜柚在贮藏过程中，汁胞PAL活性呈先上升后下降的趋势。贮藏20～40 d期间，对照组的PAL活性显著上升，且显著高于同时期的SA处理，在贮藏第40天出现PAL活性高峰，之后显著下降；在此期间（贮藏20～60 d）SA处理的PAL活性呈上升趋势，在贮藏60 d后0.5 g·L-1 SA处理组的PAL活性达到高峰，而后下降；1.0 g·L-1和1.5 g·L-1 SA处理组的PAL活性在贮藏第80天出现高峰，而后略有下降，处理说明SA处理能降低汁胞PAL活性且延缓其峰值的出现。

由图4可以看出，不同处理的‘琯溪蜜柚在贮藏过程中，汁胞CAD活性均逐渐上升。对照组在贮藏20～60 d，活性显著上升，并高于SA处理，而SA处理的CAD活性在贮藏40～60 d才出现显著升高的变化，说明适宜浓度的SA处理能显著降低汁胞CAD的活性。结果表明，果实在贮藏期间CAD活性的变化与木质素的合成呈显著正相关，相关系数为0.981。

由图5可以看出，各处理组的‘琯溪蜜柚汁胞POD活性在贮藏期间逐渐上升。贮藏前20 d，对照组的POD活性即出现显著升高的现象，而SA处理组的POD活性无显著变化，贮藏20 d后POD活性才显著上升。SA处理果的POD活性及其上升速度显著低于对照，其中1.0 g·L-1 SA抑制POD酶活性的效果最佳。

研究结果表明，在‘琯溪蜜柚的贮藏过程中，木质素生物合成关键酶PAL、CAD和POD的活性与木质素的含量和汁胞的粒化程度有相关性；适宜浓度的外源激素SA处理能够抑制PAL、CAD的生物合成过程。

3 讨 论

研究表明，汁胞粒化与木质素有关。Shomer等[14]认为汁胞粒化是汁胞木质化形成厚壁组织的结果，通过对粒化汁胞的解剖，观察到囊壁细胞的次生木质壁内镶物和复饰物的木质化造成了粒化现象[15]，本研究结果表明，木质素含量与汁胞粒化指数呈显著正相关，进一步证明了木质素的生成是汁胞木质化的主要原因之一。

在木质素合成途径中，PAL是苯丙氨酸途径的第1个关键酶，催化L-苯丙氨酸生成反式肉桂酸，最后形成木质素的酚类前体，是一个限速酶，CAD催化松柏醛形成木质素单体[16]，POD则将可溶性的木质素单体氧化聚合成不溶性的木质素聚合体，抑制这3种酶的活性能够抑制木质素的生成[17]。本研究结果表明，‘琯溪蜜柚在贮藏期间，PAL、CAD和POD与木质素合成密切相关，SA能显著抑制木质素合成关键酶PAL、CAD和POD的活性，从而抑制木质素的合成。

SA是植物内普遍存在的一种酚类化合物[18]，被认为是一种植物内源信号分子和新的植物激素，能够干扰赤霉素（GA）的信号传导或响应，从而抑制细胞木质素合成相关酶基因的表达，进而影响植物的生长[19]。吴锦程等[20]用1.0 g·L-1 SA处理贮藏期间的枇杷果实，试验结果证明外源SA能显著抑制PAL、PPO、CAD和POD的活性，降低果实木质素含量，减缓果实的木质化。在本研究中，外源SA能显著抑制贮藏期间‘琯溪蜜柚粒化指数的上升，其原因可能是外源SA抑制了木质素合成途径中相关基因的表达，因此表现为SA处理组的相关酶活性显著低于对照组，减少木质素的生成，减轻汁胞木质化程度。

4 结 论

‘琯溪蜜柚采后贮藏期间汁胞粒化程度与汁胞中木质素含量有直接的关系，SA对汁胞粒化的抑制是通过抑制木质素合成途径中关键酶的活性，以减少木质素的合成，从而减轻汁胞粒化的程度。

参考文献 References：

[1] PAN Dong-ming， ZHENG Guo-hua， CHEN Gui-xin， SHE Wen-qin， GUO Zhi-xiong， SHI Mu-tian， LIN Hui-ying. Analysis of the reasons caused granulation of juice sacs in Guanximiyou pomelo variety[J]. Journal of Fruit Science，1999， 16： 202-209.

潘东明，郑国华，陈桂信，佘文琴，郭志雄，施木田，林慧颖. 琯溪蜜柚汁胞粒化原因分析[J]. 果树科学，1999，16（3）： 202-209.

[2] BOERJAN W， RALPH J， BAUCHER M. Lignin biosynthesis[J]. Annual Review of Plant Biology， 2003， 54： 519-546.

[3] RALPH J，LUNDQUIST K， BRUNOW G， LU F， KIM H， SCHATZ P F， MARTIA J M， HATFIELD R D， RALPH S A， CHRISTENSEN J H. Lignins： natural polymers from oxidase coupling of 4-hydroxyphenylpropanoids[J]. Phytochemistry Reviews， 2004， 3： 29-60.

[4] ILAN S， EDO C， ROSA V， ELLA L， MONICA B. Scierification of juice sacs in pummelo （Citrus grandis） fruit[J]. Canadian Journal of Botany， 1989， 67（3）： 625-632.

[5] MCCAIG B C， MEAGHER R B， DEAN J F D. Gene structure and molecular analysis of the laccase-like multicopper oxidase （LMCO） gene family in Arabidopsis thaliana[J]. Planta， 2005， 221： 619-636.

[6] AYMERICK E， ANTHE G， PURBA M， JIN S K， BRIGITTE P， PETER I B. Biosynthesis and incorporation of side-chain-truncated lignin monomers to reduce lignin polymerization and enhance saccharification[J]. Plant Biotechnolgoy Journal， 2012， 10： 609-620.

[7] VANHOLME R， DEMEDTS B， MORREEL K， RALPH J， BOERJAN W. Lignin biosynthesis and structure[J]. Plant Physiology，2010， 153： 895-905.

[8] CAI Chong. Regulation of lignification and quality changes in postharvest loquat fruit[D]. Hangzhou： Zhejiang University， 2009.

蔡充.枇杷果实采后木质化与品质调控[D].杭州： 浙江大学，2006.

[9] PAN Dong-ming， CHEN Gui-xin， ZHENG Guo-hua， LIN Hui-ying， SHE Wen-qin. Effects of growth regulators on juice sac granulation in pummel fruits[J]. Journal of Fujian Agricultural University， 1998， 27（2）： 155-159.

潘东明，陈桂信，郑国华，林慧颖，佘文琴. 植物生长调节剂对琯溪蜜柚汁胞粒化的影响[J]. 福建农业大学学报，1998，27（2）： 155 -159.

[10] JU Zhi-guo. Effects of harvest date on phenolics metabolism and tissue browning of laiyang chili（pyrus bretschneideri Rehd）[J]. Scientia Agricultura Sinica， 1991， 24（2）： 63-68.

鞠志国. 采期对莱阳茌梨酚类物质代谢和组织褐变的影响[J]. 中国农业科学，1991，24（2）： 63-68.

[11] CHENG G W， BREEN P J. Activity of phenylalanine ammonia-lyase （PAL） and concentrations of anthocyanins and phenolics in developing strawberry fruit[J]. Journal of American Society for Horticultural Science， 1991， 116（5）： 865-869.

[12] GOFFER D， JODDROY J， GRIMA P J， HALPIN C， KNIGHT M E， SCHUCH W， BOUDET A M. Purification and characterization of isoforms of cinnamyl alcohol denydrogenase from Eucalyptusxylem [J]. Planta， 1992， 188（1）： 48-53.

[13] MELONI D A， OLIVA M A， MARTINEZ C A， CAMBRAIA J. Photosynthesis and activity of superoxide dismutase， peroxidase and glutathione reductase in cotton under salt stress[J]. Environmental and Experimental Botany， 2003， 49： 69-76.

[14] SHOMER I， CHALUTZ E， VASILIVER R， LOMANIEC E， BERMAN M. Scierification of juice sacs in pummelo （Citrus grandis） fruit[J]. Canadian Journal of Botany， 1989， 67（3）： 625-632.

[15] SHE Wen-qin. An analysis on physiological changes and gene differential expressions in the process of pummelo fruit[Citrus grandis （L.） Osbeck] juice sac granulation[D]. Fuzhou： Fujian Agricultural and Forestry University，2009.

佘文琴. 琯溪蜜柚汁胞粒化过程中生理变化与基因差异表达分析[D]. 福州： 福建农林大学， 2009.

[16] BAUCHER M， PETIT-CONIL M， BOERJAN W. Lignin： genetic engineering and impact on pulping[J]. Critical Review Biochemistry Molecular Biology， 2003， 38： 305-350.

[17] VANHOLME R， MORREEL K， RALPH J， BOERJAN W. Lignin engineering[J]. Current Opinion in Plant Biology，2008，11： 278-285.

[18] AN C F， MOU Z L. Salicylic acid and its function in plant immunity[J]. Journal of Integrative Plant Biology， 2011， 53（6）： 412-428.

[19] LINA G G， LUIS E T， LISA A J， RICHARD A D. Salicylic acid mediates the reduced growth of lignin down-regulated plants[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of USA， 2011， 108（51）： 20814-20819.

[20] WU Jin-cheng， CHEN Qun， TANG Chao-hui， XIA Hai-lin. Effects of exogenous salicylic acid on lignification and related enzymes activities of loquat during cold storage[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering， 2006， 22（7）： 175-179.

吴锦程，陈群，唐朝晖，夏海琳. 外源水杨酸对冷藏枇杷果实木质化及相关酶活性的影响[J]. 农业工程学报，2006，22（7）： 175-179.