生物有机肥对香蕉枯萎病及根系分泌物的影响

赵兰凤，胡伟，刘小锋，张亮，李华兴

华南农业大学资源环境学院，广东 广州 510642

根系分泌物是植物与外界环境进行物质交流的重要媒介, 是构成植物不同根系微生态环境特征的主要物质之一。因此，研究根系分泌物对于进一步明确植物的生理活动规律及其与环境之间的关系具有重要的理论和实际意义[1]。植物根系分泌物作为寄主自身抗病性的第一阶段(侵染前阶段)起着不可忽视的作用。Larkin[2]在研究连种西瓜对枯萎菌及根际微生物群落的影响时，发现在连种抗病品种的田块中，即便加入中等量的病原菌和种植感病品种，发病率也不会很高，而在种植感病品种的田块中仍保持很高的发病率。也有研究表明，小麦根系分泌物可以明显控制病原菌引起的全蚀病和粉霉病等病害[3], 水葫芦根系分泌物能抑制金黄色葡萄球菌的生长[4]。目前国内外有关环境胁迫下植物根系分泌物的研究主要集中在根系分泌物的种类和数量、分泌物与环境因子的相互联系以及植物体的响应上，虽然也有一些关于植物土传病害与根系分泌物关系方面的研究报道[5-7]，而施用生物有机肥防治香蕉枯萎病与根系分泌物的关系研究还鲜见报道。生物有机肥的施用作为防治香蕉枯萎病的有效措施之一[8-9]，无疑会改变根系分泌物的数量和组成，进而影响其防病效果。深入研究生物有机肥对香蕉根系分泌物组成及活性物质影响，对于探讨生物有机肥的抗病机制具有重要意义。本研究通过盆栽试验和离位溶液培养法研究了生物有机肥对香蕉枯萎病及香蕉根系分泌物的影响，试图探讨生物有机肥在植物-土壤-微生物三者之间的作用及其防病机理。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试土壤

采自华南农业大学农场由赤红壤发育而成的水稻土。其主要理化性质为：质地为轻壤土；w(有机质)=12.1 g·kg-1；pH值5.98；w(碱解N)、w(有效P)和w(速效K)分别为50.0、46.0和143.1 mg·kg-1。测定方法参照《土壤农业化学分析方法》[10]。

表1 供试肥料的基本性质 Table 1 Basic characteristics of two fertilizers

1.1.2 供试肥料

供试肥料及其基本性质如表1所示。

1.1.3 供试作物

香蕉：巴西焦(Musa acuminata AAA Cavendish cv. Brazil)，营养杯组培苗，广东省农业科学院果树研究所提供。

1.1.4 病原菌 尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种Fusarium oxysopoyum f. sp. cubence race 4 (Foc4)。

1.1.5 生物有机肥料中添加菌种

解淀粉芽孢杆菌(AF11b，B. amyloliquefaciens)，由本试验室筛选、分离并鉴定，对香蕉枯萎病病原菌FOC4有较强的拮抗能力。

1.2 方法

1.2.1 试验设计

试验采用盆栽的方式，2011年5月在资源环境学院网室中进行。试验共设3个处理，分别为不施肥处理(CK)、施有机肥处理(OF)和施生物有机肥处理(BOF)。每个处理设20个重复，共60盆。

每盆装风干土(过3 mm筛)5 kg，生物有机肥和有机肥施用量为8 g·kg-1土，全部作为底肥与土壤混匀。土壤浇水平衡5 d后移栽香蕉苗，选择生长大小一致香蕉苗移植，每盆种植1株香蕉苗，在移栽的同时采用灌根法接种病原菌，病原菌菌液中孢子浓度为105mL-1，每盆浇20 mL。观察香蕉生长和枯萎病发生情况，生长30 d后收获蕉苗，观察地上部茎、叶黄化和枯萎情况，切开根部记录褐变程度。香蕉枯萎病病情指数和防病效果计算参考相关文献[11]。

1.2.2 根系分泌物提取

根系分泌物收集采用离位溶液培养法[12-13]：将盆栽中的蕉苗从土壤中拔出，先用自来水冲洗3～5次，洗掉附着的土粒，之后用超纯水冲洗2～3次。将蕉苗置入50 mL 5 mmol·L-1氯化钙溶液中避光收集根系分泌物，每4株放入一个收集瓶中。连续收集6 h，慢速过滤(0.45 μm的微孔滤膜)。将收集到的根系分泌物定容到50 mL，取35 mL滤液真空冷冻干燥至干，加0.5 mL去离子水溶解，用于分析氨基酸。取15 mL滤液真空冷冻干燥至干，加1 mL去离子水溶解，用于分析低分子量有机酸。

1.2.3 根系分泌物中有机酸和氨基酸测定

（1）氨基酸组分测定：用日本L-8800氨基酸自动分析仪测定。

（3）有机酸类型和质量浓度采用高效液相色谱测定。安捷伦LC1100液相色谱仪（美国产），流动相：5 mmol·L-1H2SO4，流速：0.5 mL·min-1，进样量：10 μL，检测波长：210 nm。

1.2.4 数据分析

试验数据用Excel 2003和DPS 7.05软件处理，显著性水平采用Duncun’s新复极差法分析。

2 结果与分析

2.1 生物有机肥对香蕉枯萎病的防治效果

接种香蕉枯萎病菌10 d后，不施肥处理(CK)最先开始发病，有机肥处理(OF)和生物有机肥处理(BOF)推迟香蕉枯萎病的发生。CK发病明显，而且发病株数最多，OF次之，种植30 d时病情指数如图1所示，BOF和OF防病效果分别达到55.4%和28.5%。说明施生物有机肥和有机肥可显著降低香蕉枯萎病的发病率。

图1 不同处理对香蕉枯萎病病情指数影响 Fig.1 Influence of different treatments on banana wilt disease index

2.2 生物有机肥对根系分泌物中有机酸质量浓度的影响

从香蕉根系分泌物中的有机酸结果(表2)可以看出，香蕉根系分泌物中包括3种低分子量有机酸，其中草酸质量浓度最高，苹果酸质量浓度次之，与张志红[11]测定结果相似。OF和BOF处理根系分泌物中草酸和反丁烯二酸质量浓度显著高于CK，苹果酸质量浓度则是CK和OF显著高于BOF，反丁烯二酸质量浓度甚微，变化趋势与草酸相似，且OF处理显著高于BOF处理。影响有机酸总量的主要有机酸为草酸，不同处理根系分泌物的有机酸质量浓度为OF＞BOF＞CK，差异均达到显著水平。上述结果表明，施肥可显著影响根系分泌物中有机酸的质量浓度。与OF处理相比，BOF显著降低了根系分泌物中有机酸质量浓度，表明生物有机肥中添加的功能菌对于降低根系分泌物中有机酸质量浓度具有显著的作用。本研究结果与张志红[13]等测定结果相似，研究表明，施用BOF香蕉根系分泌物中低分子量有机酸质量浓度降低，且有机酸质量浓度与防病效果变化呈相反趋势[14-15]。

表2 不同处理根系分泌物中有机酸质量浓度 Table 2 The contents of organic acids in root exudates in different treatments mg·L-1

2.3 生物有机肥对根系分泌物中氨基酸质量浓度的影响

表3 不同处理根系分泌物中氨基酸质量浓度 Table 3 The contents of amino acids in root exudates in different treatments μg·L-1

从表3可以看出，施肥对根系分泌物中氨基酸的质量浓度和种类均有影响。BOF处理中氨基酸种类和总量最多，OF次之。施肥处理的磷酸丝氨酸、a-氨基丁酸和γ-氨基丁酸等17类氨基酸质量浓度均高于CK处理，牛磺酸、瓜氨酸、3-甲基-组氨酸和鹅肌肽质量浓度则相反，表明施用BOF和OF增加了氨基酸的种类和总量。BOF处理中γ-氨基丁酸、β-丙氨酸、a-氨基丁酸、谷氨酸、肌肽、天冬氨酸和磷酸丝氨酸质量浓度均显著高于OF；BOF根系分泌物中主要氨基酸有磷酸丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、γ-氨基丁酸、乙醇氨和肌肽，其中磷酸丝氨酸和γ-氨基丁酸质量浓度显著高于OF。以上结果表明，施用BOF后明显提高根系分泌物中氨基酸质量浓度，说明BOF中添加的拮抗菌对根系分泌物中氨基酸的质量浓度有显著影响。

为明确香蕉根系分泌物中氨基酸组分与枯萎病抗性之间的关系，对根系分泌物中氨基酸组分与香蕉枯萎病的重要抗病性指标—病情指数—进行相关性分析(表3)，结果表明，香蕉病情指数与磷酸丝氨酸、丝氨酸、异亮氨酸质量浓度呈显著负相关，与鹅肌肽呈极显著正相关；与牛磺酸、胱氨酸、羟赖氨酸、3-甲基-组氨酸质量浓度呈正相关，与天冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸、甘氨酸、a-氨基丁酸、亮氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、赖氨酸质量浓度呈负相关，相关系数均大于0.85，但未达到显著相关水平。

3 讨论

对多种土传病害的研究结果表明，根系分泌物的细小变化都会导致包括土壤病原菌在内的根际微生物区系的极大变化[16-17]，它是联系植物和根际土壤微生物的重要媒介[18]。已有研究[19]表明，不同植物根系分泌物的氨基酸种类与数量有明显差异。张俊英等[20]研究大豆根系分泌物中氨基酸对根腐病菌生长的影响时发现，感病大豆品种根系分泌的主要氨基酸为精氨酸，抗病大豆品种根系分泌的氨基酸主要为天冬氨酸。潘凯和吴凤芝[21]研究表明，根系分泌物中总氨基酸质量浓度随品种抗性的增加而降低，精氨酸、丝氨酸和赖氨酸的质量浓度与品种对枯萎病的病情指数呈负相关。韩丽梅等[22]研究结果表明，抗病品种根系分泌物中精氨酸比感病品种高1.02倍，感病品种根系分泌物氨基酸组分则对大豆根腐病病菌具有显著的促进作用。有研究结果表明，不同大豆品种根系分泌的有机酸种类多少存在差异，而且同种有机酸的分泌量也因品种而异, 表现为感病品种的数量高于抗病品种[14]。这些研究结果[17,23]表明，根系分泌物与抗病性的关系主要体现在根系分泌物成分对根际微生物的影响。根系分泌物是影响土壤中病原菌生长繁殖的重要因素，与土传病害密切相关。本研究结果表明，生物有机肥不仅为植物提供了大量养分且改善了微生态环境[8]，还促进了植物的生长并提高了植物的抗病性，这与根系分泌物的改变有密切关系。由此可见，根系分泌物在植物的抗病作用中起着不可低估的作用。生物有机肥可减少香蕉枯萎病发生，与其影响香蕉根系分泌物有关，这为香蕉枯萎病减轻的原因提供了一定理论依据。但还应深入研究有差异表达的氨基酸和有机酸在对香蕉枯萎病病原菌生长的影响，以进一步明确生物有机肥防治香蕉枯萎病的机制。

已在相关研究[20-21]中验证了丝氨酸、精氨酸对黄瓜枯萎病病菌的生长发育有显著的抑制作用，而苯丙氨酸、甘氨酸、天冬氨酸和丙氨酸对黄瓜枯萎病病菌的生长发育有明显的促进作用。本研究所得的相关性分析结果能否作为香蕉枯萎病抗性的鉴定指标，需要进一步检验。

4 结论

综上所述，本试验可以得出以下几点结论：

（1）生物有机肥和有机肥可以有效防治香蕉枯萎病，防病效果分别达到55.4%和28.5%。

（2）生物有机肥比有机肥更明显降低了各低分子量有机酸质量浓度，且显著降低了有机酸总量质量浓度。

（3）生物有机肥和有机肥的施用都提高了根系分泌物中氨基酸的总量和种类，但生物有机肥的效果更显著。

（4）香蕉枯萎病病情指数与磷酸丝氨酸、丝氨酸、异亮氨酸质量浓度呈显著负相关，与鹅肌肽质量浓度呈极显著正相关。

[1] 罗睿, 何刚. 根系分泌物的研究现状及其在农业和环境中的应用[J]. 贵州农业科学, 2011, 39 (4): 48-51.

[2] LARKIN R P. Effect of successive watermelon plantings on Fusarium oxysporum and other microorganisms in soils suppressive and conductive to Fusarium of watermelon[J]. Phytopathology, 1993, 83: 1097-1104.

[3] SMILEY RW, COOK R J. Relationship between take-all of wheat and rhizosphere pH in soils fertilized with ammonium vs. nitrate-nitrogen [J]. Phytopothol, 1973, 63: 882-890.

[4] 郑师章, 何敏. 水葫芦根部分泌物对若干细菌作用的研究[J]. 生态学杂志, 1990, 9(5): 56-57.

[5] 周宝利, 尹玉玲, 李云鹏, 等. 嫁接茄根系分泌物与抗黄萎病的关系及其组分分析[J]. 生态学报, 2010, 30(11) : 3073-3079.

[6] 黄奔立, 许云东, 伍烨, 等. 两个不同抗性黄瓜品种和云南黑籽南瓜根系分泌物对黄瓜枯萎病发生的影响[J]. 应用生态学报, 2007, 18(3): 559-563.

[7] 吴玉香, 沈晓佳, 房卫平, 等. 陆地棉根系分泌物对黄萎病菌生长发育的影响[J]. 棉花学报, 2007, 19(4): 286-290.

[8] 张志红, 冯宏, 肖相政, 等. 生物肥防治香蕉枯萎病及对土壤微生物多样性的影响[J]. 果树学报, 2010, 27(4): 575-579.

[9] 张志红, 李华兴, 韦翔华, 等. 生物肥料对香蕉枯萎病及土壤微生物的影响[J]. 生态环境, 2008, 17(6): 2421-2425.

[10] 鲁如坤. 土壤农业化学分析方法[M]. 北京: 中国农业出版社, 2000: 12-284, 421-429.

[11] XU Z G. General Plant Pathology[M].Beijing: China Agricultural Press, 2002: 236-262.

[12] 许超, 林小方, 夏北成. 玉米幼苗根系分泌物对芘污染的响应[J]. 生态学报, 2010, 30(12): 3280- 3288.

[13] 张志红, 赵兰凤, 李华兴, 等. 生物有机肥对香蕉幼苗根系分泌物的影响[J]. 华南农业大学学报, 2011, 32(1): 11-14.

[14] 张俊英, 王敬国, 许永利. 不同大豆品种根系分泌物中有机酸和酚酸的比较研究[ J]. 安徽农业科学, 2007, 35(23): 7127-7129.

[15] 鞠会艳, 韩丽梅, 王树起, 等. 连作大豆根分泌物对根腐病病原菌的化感作用[J]. 应用生态学报, 2002, 13(6): 723-727.

[16] 韩雪, 潘凯, 吴凤芝. 不同抗性黄瓜品种根系分泌物对枯萎病病原菌的影响[J]. 中国蔬菜, 2006, 5: 13-15.

[17] BAIS H P, WEIR T L, PERRY L G, et al. The role of root exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms[J]. Annual Review of Plant Biology, 2006, 57: 233-266.

[18] BAIS H P, PARK S W, WEIR T L, et al.How plants communicate using the underground information superhighway[J].Trends in Plant Science, 2004, 9(1): 26-32.

[19] FRANCISCO J.Root exudates of wildoates allelopathic effect Oil springwheat[J]. Phytochem, 1991, 30: 2199-2201.

[20] 张俊英, 王敬国, 许永利. 大豆根系分泌物中氨基酸对根腐病菌生长的影响[J]. 植物营养与肥料学报, 2008, 14(2): 308-315.

[21] 潘凯, 吴凤芝. 枯萎病不同抗性黄瓜(Cucumis sativus L. )根系分泌物氨基酸组分与抗病的相关性[J]. 生态学报, 2007, 27(5): 1945-1950.

[22] 韩丽梅, 鞠会艳, 杨振明, 等. 两种基因型大豆根系分泌物对大豆根腐病病菌的化感作用[J]. 应用生态学报, 2005, 16 (1) : 137-141.

[23] BERTIN C, YANG X, WESTON L A. The role of root exudates and allelochemicals in the rhizosphere[J]. Plant and Soil, 2003, 256(1): 67-83.