凝胶渗透色谱-液相色谱法测定熏烤肉制品中的苯并（a）芘

郑睿行，夏爱萍，祝华明，张旭，鲍利锋

（衢州市质量技术监督检测中心，浙江衢州 324002）

熏烤肉制品中多环芳烃主要来源于加工过程中有机物的不完全燃烧并在肉制品表面沉积，脂肪、蛋白质等有机物在高温下的分解[1-3]。现在已知的熏烤肉制品中多环芳烃（PAHs）[4-7]，其中以苯并（a）芘（benzo（a）pyrene，简称B（a）P）为代表，是一种强致癌物，它是多环芳烃类中毒性最大的一种，其毒性超过黄曲霉毒素。食用受其污染的食品，具有公认的致畸、致癌的慢性毒性，在熏烤过程中严重污染食品。目前许多国家已将PAHs 列为食品有害物质监测的重要内容之一，其中苯并（a）芘的关注程度最为广泛，德国已对肉制品中苯并（a）芘的残留制定了限量标准1 μg/kg，我国国标GB 2762-2005《食品中污染物限量》限定苯并（a）芘在肉制品中的最高残留量为5 μg/kg。

苯并（a）芘的检测方法已经有国标法GB/T 5009.27-2003《食品中苯并（a）芘的测定》以及不少研究文献提供的方法[8-9]，但其测定方法仍有诸多不足之处，尤其是对样品中苯并（a）芘提取[10-11]、净化与浓缩方面缺乏先进的方法。目前报道的净化技术主要有固相萃取、液-液萃取等方法。凝胶渗透色谱（Gel Permeation Chromatograph，GPC）作为一种新型的样品净化技术，已经成功应用于各类中药类样品、环境样品和食品样品进行分析。熏烤肉制品中含有大量的高分子物质，比如色素、油脂、糖类等，造成色谱分离效率大大降低，所以这类样品必须进行有效的净化。

本研究应用全自动凝胶渗透色谱和固相萃取技术对熏烤肉制品进行提取、净化并定量浓缩，并结合反相高效液相色谱-荧光法对GPC 处理后的样品进行分析，建立一种检测熏烤肉制品中苯并（a）芘残留的分析方法。该方法快速简便，自动化程度高，可进行大批量自动化分析，灵敏度高且重现性好。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与材料

1.1.1 试剂与材料

熏烤肉制品：市售；苯并（a）芘标准品（纯度≥99%）：国家标准物质中心；乙腈（HPLC 纯）、环己烷（农残级）、乙酸乙酯（农残级）：美国J.T.Baker 公司；高纯氮（纯度≥99.999%）：浙江巨化股份有限公司；水（去离子化纯净水）。

1.1.2 实验仪器

1.2 样品的制备

将烤肉搅碎，匀质。准确称取5.00 g 于离心管中，加入30 mL 正己烷∶丙酮（1 ∶1，体积比）混合溶液，超声提取40 min。提取液4 000 r/min 离心10 min，上清液氮吹浓缩至干，用环己烷/乙酸乙酯（1 ∶1，体积比）溶解并定容至10 mL，剧烈摇匀，4 000 r/min 离心10 min，上清液转移至16 mL 进样瓶中，通过GPC 二联机模式对样品进行净化，净化后浓缩，用环己烷/乙酸乙酯（1 ∶1，体积比）定容至2 mL，最后收集1 500 μL 洗脱液到玻璃样品瓶中，用氮气吹至近干，用1.5 mL 正己烷：丙酮（1 ∶1，体积比）混合液溶解残渣，过预先用5 mL正己烷活化的硅胶柱，收集洗脱液，氮吹至干，用乙腈定容至750 μL，小心涡旋溶解残渣，避免样品瓶盖与溶剂接触。然后将10 μL 试样液注入高效液相色谱仪进行测定。

2 结果与讨论

2.1 提取条件的优化

2.1.1 提取溶剂的选择

根据相关参考文献报道，初选出有代表性的二氯甲烷、丙酮、正己烷。采用超声波辅助提取法比较以上3 种溶剂及其混合液的提取效果。通过考察苯并（a）芘提取效率，发现正己烷和丙酮混合液的提取效果最高。分别添加相同体积但比例不同的正己烷和丙酮提取液进行进一步的优化实验，结果发现，60%（体积比）正己烷丙酮溶液作为样品提取溶液时，所得到的提取物中苯并（a）芘含量最高。

2.1.2 提取时间的选择

选择不同的提取时间（10、20、30、40、60、80 min）进行实验。结果表明，在40 min 内，随着超声时间的增加，待测物提取率明显增加，但超声时间40 min 后，提取率基本无变化，因此本实验提取时间为40 min。

2.2 GPC 净化条件的选择

2.2.1 净化样品量的选择

分别称取2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 g 熏烤肉制品，按1.2 所述方法进行提取，结果表明，当净化样品量为2.0 g 时不能满足仪器的方法检出限；当净化样品量在4.0 g～6.0 g 时能够达到添加回收标准且能满足仪器的检测要求；当净化样品量大于8.0 g 时，基质干扰大，净化效果不理想。因此净化样品量宜在4.0 g～6.0 g。

2.2.2 收集时间的确定

设置流速为5.0 mL/min，以2 min 为间隔，分段收集。检测结果显示，目标物均在21 min 以后出峰，且在42 min 内收集完毕。故将收集时间设定为前运行时间：1 300 s；主收集时间：1 200 s；脱尾时间：300 s。

2.3 GPC 的净化浓缩条件

GPC 柱：500 mm×25 mm glass column，Bio-Beads，TypeS-X3，200-500；样品定量环：5.0 mL；流速：5 mL/min；油浴温度：40 ℃；循环冷却水温度：4.0 ℃；前运行时间：1 300 s；脱尾时间：300 s；主收集时间：1 200 s；样品收集体积：1 500 μL；真空参数（阶段1 压力：180 mbar，阶段2 压力：200 mbar）。

2.4 反相高效液相色谱检测条件

高效液相色谱仪配备荧光检测器；色谱柱：多环芳烃分析柱（Eclipse PAH，4.6×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（92 ∶8，体积比）；波长：激发波长384 nm（狭缝10 nm），发射波长406 nm（狭缝10 nm）；流速：1.2 mL/min；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。在此条件下，测得苯并（a）芘保留时间15.253 min，样品溶液中主峰和其它杂峰达到完全分离。标准品、样品的色谱图见图1、图2。

图1 苯并（a）芘标准溶液色谱图Fig.1 RP-HPLC chromatogram of Benzo（a）Pyrene standard substance

图2 熏烤肉制品的RP-HPLC 色谱图Fig.2 RP-HPLC chromatogram of the Smoked meat products

2.5 方法的线性范围、相关系数及仪器检出限

按选定的色谱条件对苯并（a）芘标准系列浓度进行RP-HPLC 分析，以保留时间定性，以峰面积对浓度绘制工作曲线图1，图1 结果表明，在0～20 μg/L 范围内，其线性回归方程为y=1.353 8x－0.204 5，线性相关系数r2=0.999 6。连续11 次进空白样，以基线3 倍噪声值在标准曲线查得结果，并通过计算得出样品方法检出限为0.15 μg/kg。

图3 苯并（a）芘标准品标准曲线Fig.3 The standard curve for Benzo（a）Pyrene standard substance

2.6 方法精密度和加标回收试验

向5.00 g 左右的无苯并（a）芘残留的熏烤肉制品中加入20.0、50.0、100.0 ng 的苯并（a）芘标准物质。按照本文1.2 处理方法对样品进行前处理，在本文所述的最佳色谱条件下，每个浓度进行6 次平行试验，外标法计算平均回收率，结果见表1。

从表1 可见，加标回收率范围在85.9%～94.3%之间；RSD 在2.8%～4.6%，均小于5%，说明该方法具有较高的可靠性，系统误差小，精密度高，符合实验要求。

表1 回收率实验测定结果（n=6）Table 1 Determination results of recovery（n=6）

2.7 质控样品比对试验

本方法用5 种不同浓度的质控样品进行测试分析。精确称取5.00 g 左右熏烤肉制品，按照本文所述的GPC 净化浓缩条件对样品进行前处理，用最佳的HPLC 色谱条件对样品进行分析。测定结果见表2。

表2 质控样品的苯并（a）芘测定值与结果Table 2 QC sample by Benzo（a）Pyrene determination and results

从表2 可见，3 种不同浓度的质控样品的测定值与实际参考值进行比对，相对偏差为3.5%～7.6%，分析结果准确，可靠，方法具有广泛的应用价值。

3 结论

1）熏烤肉制品基质成分复杂，大分子有机物种类繁多，前处理不好直接影响检测结果的判定。与GB/T 5009.27-2003《食品中苯并（a）芘的测定》的前处理方法相比，本文采用的凝胶渗透色谱制备样品可以提高分析的准确度和精密度，并且大大提高了工作效率。

2）本研究采用凝胶渗透色谱-固相萃取-高效液相色谱联用技术对熏烤肉制品中苯并（a）芘残留量进行测定，以保留时间定性，外标法定量。结果表明：苯并（a）芘在0～20 μg/L 的浓度范围内，其线性相关系数是0.999 6，最低检出限为0.15 μg/kg，加标回收率为85.9%～94.3%，相对标准偏差为2.8%～4.6%。该方法是一种快速、灵敏、稳定可靠的测定熏烤肉制品中苯并（a）芘残留量的方法，对五种不同浓度质控样品进行了测试分析，均获得了满意的结果，符合熏烤肉制品中苯并（a）芘残留量检测的技术要求。

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