实验室2种检测小儿巨细胞病毒方法的比较

李 娇，马洪刚，单风平*

(1.中国医科大学 免疫教研室，辽宁 沈阳 110001;2.沈阳市儿童医院检验科，辽宁 沈阳 110001)

人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)是一类在自然界普遍存在，但又具有严格种属特异性的病毒。人类HCMV感染非常普遍，并且是人巨细胞病毒的唯一宿主［1］。初次感染多在2岁以下，大多呈隐性或潜伏感染，但在一定条件下侵袭多个器官和系统可产生严重疾病。小儿机体阻抑HCMV的入侵能力极弱，故很容易受感染，尤其是胎儿及免疫力低下的婴儿更易受其侵害。HCMV感染即便有症状，也无特征性，要确诊HCMV感染，主要依靠实验室检查［2］。病毒分离虽为金标准，但HCMV分离培养困难，费时耗力，临床应用较少。临床一般用血清学方法和分子生物方法辅助诊断。目前较多实验室采用ELISA或胶体金法检测血清中特异性人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)抗体，但检出率较低且只能定性。PCR荧光检测定量准确，是值得推广的一种技术手段。本文将胶体金和PCR 2种方法进行对比分析，为HCMV感染的诊断提供及时准确的实验室结果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 对象 本研究收集2012年4月至2012年10月因新生儿肺炎，支气管炎，肠炎，新生儿黄疸等病因在我院住院的243例疑似HCMV感染的患儿，年龄为1 d～9个月，男∶女为146∶97;诊断标准参考CMV感染诊断方案［3］。

1.1.2 标本采集 空腹抽取患儿静脉血2 mL置于灭菌的一次性非抗凝试管中，取分离出的血清0.2 mL密闭送检。溶血标本应重新抽取血样，若甘油三酯含量超过6 mmol/L或肉眼可见血清呈白色混浊状的标本，应4℃ 13 000 r/min离心15 min，吸取下层清亮血清送检。血清标本在2～8℃可放置72 h，－70℃可长期保存，标本不宜反复冻融。

1.1.3 仪器与试剂 HCMV-IgM试剂盒由艾康生物技术(杭州)有限公司生产，HCMV-DNA采用美国ABI 7300 Real-time PCR system分析仪，试剂盒购自上海之江生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 HCMV-IgM检测 胶体金法检测血清中特异性HCMV-IgM，操作和结果的判断严格按照试剂盒说明书进行，20 min内出现2条紫红色条带(一条位于测试区内，另一条位于质控区内)为阳性。在测试区内无紫红色条带出现，仅质控区出现一条紫红色条带为阴性。质控区未出现紫红色条带，说明此试剂作废。

1.2.2 HCMV-DNA 检测 取血清50 μL置于1.5 mL无菌EppendoH离心管中，加入50 μL DNA专用提取液，震荡10 s，99℃水浴10 min，取上清4 μL加入HCMV-DNA检测体系中，在ABI 7300分析仪上进行检测。循环条件为37℃ 2 min，94℃ 2 min，循环1次，再按93℃ 15 s，60℃1 min，循环40次，单点荧光检测在60℃，反应体系为40 μL，;阴阳性对照、CMV DNA标准品(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)同时进行检测。扩增结束后通过电脑分析得出定量结果。结果大于1 000拷贝/mL判定为阳性。

1.2.3 统计学处理 采用SPSS 13.0统计分析软件对数据进行配对资料的卡方检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 对243例标本的PCR法与胶体金法结果阳性率比较

243例标本进行荧光定量PCR检测HCMVDNA，阳性率为11.93(29/243)，胶体金检测HCMV-IgM，阳性率为6.58(16/243);血清HCMVDNA和HCMV-IgM检测阳性率差异有统计学意义(P＜0.01)。2种检测方法CMV-IgM阳性率比较，实时荧光定量PCR法阳性率高于胶体金法，差异有统计学意义(P＜0.01)。见表1。

表1 2种检测方法阳性率的比较Table1 The positive comparison of the two kinds of detection methods

29例HCMV-DNA阳性标本中，HCMV-IgM阳性16例，HCMV-DNA在2.11×103～4.58×106拷贝/mL之间，平均3.43×105拷贝/mL。HCMV-IgM阴性13例，HCMV-DNA在1.25×103～5.30×105拷贝/mL之间，平均2.32×104拷贝/mL。比较二者平均拷贝数，差异有统计学意义(P＜0.01)。

2.2 对243例标本的PCR法与胶体金法结果敏感性比较

本研究243例患儿，结合临床症状及相关检查，诊断为CMV感染者40例，发病率为16.4%。2种检测方法敏感性比较，见表2。

表2 2种检测方法敏感性的比较Table2 The sensitivity comparison of the two kinds of detection methods

3 讨论

儿童是HCMV感染的易感人群。研究发现，HCMV的组织嗜性与宿主年龄和免疫状态密切相关［4-5］。HCMV感染主要集中在围生期感染，这一感染可能与母乳等有关，通过母体病毒进行传播感染，一般围生期HCMV感染主要通过乳汁、产道、血液制品等进行直接传递。围生期HCMV患者主要症状有:早产、听力运动障碍、脑瘫、癫痫、肝功能异常等现象［6］。HCMV患者中，中枢系统损害患者通常会伴有一些脑瘫，智力低等后遗症［7］。在临床中，需要注意6个月以内的婴儿一般是HCMV的高发群体，其损害特征与婴儿的年龄有一定的关系，较大一些的婴儿主要体现为脑损害，较小的新生婴儿(2～3个月)表现为高胆红素血症，而1～2个月的婴儿多出现支气管肺炎症状。HCMV具有潜伏-活化的生物学特性［8］，一旦侵入人体将长期或终身存在于体内，区分HCMV的潜伏感染和活动性感染对临床治疗和判断预后至关重要。3岁以内婴幼儿为HCMV活动性感染发生的高发年龄组［9］。目前HCMV-IgM抗体被用作实验室诊断活动性HCMV感染的重要指标之一［10］，其阳性提示近期有HCMV活动性感染。因此及早诊治HCMV感染患儿，实验室检查尤其重要。病毒分离是诊断HCMV感染的金标准，但不能满足临床需求。临床实用的方法包括血清学测定HCMV特异抗体，即HCMV-IgM;荧光定量PCR技术测定血HCMV-DNA。近年来，随着荧光定量PCR在临床检测的开展，越来越多的研究结果表明荧光定量PCR较传统检测方法具有更好的灵敏度和特异性［11-12］。而HCMV-IgM抗体检测是诊断HCMV活动性感染的有效指标，荧光定量PCR则是通过检测HCMV-DNA水平，来监测病毒活跃程度。HCMV-IgM特异性抗体是HCMV进入机体后最先产生的抗体，它在体内持续时期一般不超过4个月。从患者血清中检出HCMVIgM抗体，就表明患者最近发生了原发性HCMV感染或活动性HCMV感染。使用血清学方法检测HCMV-IgM实际上是检测人体对HCMV感染的免疫反应状态，无法检测病毒自身，也就无法更准确灵敏地反映HCMV感染情况［13］。在免疫抑制状态下，HCMV抗体产生常延迟或缺乏，影响阳性检出率，因此血清抗HCMV-IgM对诊断HCMV感染有一定的局限性。实时荧光定量PCR(Realtime PCR)是进行临床基因诊断的新型定量检测方法，不但具有PCR的高灵敏性、探针技术的高特异性和光谱技术的高精确定量的优点，而且在检测过程中采用闭管体系，以及全自动定量分析，不需要PCR后处理，避免了扩增产物污染造成的假阳性结果。Real-time PCR的另一个优点是可以对HCMV进行定量检测，对长期使用免疫抑制剂的移植患者或特异性感染患者，可依据病毒荷载量的变化合理进行临床治疗，并可更加有效地评估患者的治疗效果［14］。

选择临床上243例小儿标本，同时采用荧光定量PCR法和胶体金法检测外周血中HCMVIgM的水平。其中实时荧光定量PCR法阳性率为11.93%，而胶体金法为6.58%，两者差异有统计学意义(P＜0.01)，进一步分析，13例PCR法检测阳性而胶体金法检测阴性的患儿，其PCR法检测的平均拷贝数为2.32×104拷贝/mL，说明了PCR法更具有准确度。又对其敏感性进行了比较，PCR法的敏感性为72.5%，胶体金法的敏感性为40.0%，两者差异有统计学意义(P＜0.01)，说明了PCR法更具有敏感度。在HCMVIgM抗体阳性患者中HCMV-DNA拷贝数平均值高于阴性患者(P＜0.05)，证实了HCMV-DNA定量检测结果符合HCMV的致病机制即活动性HCMV感染中的病毒量高于潜伏性感染者。但由于两组HCMV-DNA拷贝数重叠范围大，未得到明确的DNA拷贝数界限预测HCMV活动性感染，国外研究显示大于5×103具有较高的患巨细胞病毒病的风险［15］。因此，血清HCMV-IgM对诊断HCMV感染有一定的局限性，利用实时荧光定量PCR定量检测HCMV-DNA的方法比HCMV-IgM检测能更灵敏地反映HCMV感染，对于小儿巨细胞病毒疾病诊断也更具有临床价值，但是在时间及操作上，胶体金法更占有优势。

［1］张之南，沈悌.血液病诊断及疗效标准(第3版)［M］.北京:科学出版社，2007:232-235.

［2］Revello MG，Gerna G.Diagnosis and management of human cytomegalovirus infection in the mother，fetus ，andnewborn infant［J］.Clin Microbiol Rev，2002，15(4):680-715.

［3］中华医学会儿科学分会感染消化学组.巨细胞感染诊断方案［J］.中华儿科杂志，1999，37(7):441-442.

［4］Mocarski ES Jr.Cytomegalovirus:General features(human)［M］.Webster RG，Granoff A.Encyclopedia of virology.San Diego:Academic Press，1994:292-298.

［5］Demmler GJ，Feigin RD，Chrry JD，et al.Textbook of pediatric infectious'diseases5th［M］.Philaephia:Saunders，2004:1912-1932.

［6］孙佃军.更昔洛韦治疗婴儿巨细胞病毒性肝炎不良反应的临床观察［J］.重庆医学，2011，40(13):1307-1308.

［7］段凤英，吴明昌，闫宗荣.婴儿巨细胞病毒感染临床及pp65抗原检测分析［J］.中华全科医师杂志，2009，8(9):72-73.

［8］周君霞，何林.荧光定量PCR技术在小儿尿液巨细胞病毒检测中的应用［J］.中国热带医学，2007，7(5):717-718.

［9］张松丽，吴佩婷.小儿巨细胞病毒感染活动的相关因素分析［J］.现代-临床医学生物工程学杂志，2000，6(4):303-304.

［10］王卓莹，王缦，陈华，等.巨细胞病毒感染PCR检测方法的建立［J］.中国生物制品学杂志，2008，21(3):231-234.

［11］王式春，徐亚军，刘渠.荧光定量PCR在肺结核临床诊断及疗效评估中的应用［J］.华南预防医学，2011，37(5):14-18.

［12］倪红霞，刘志辉，郑学星，等.TaqMan探针荧光定量PCR支原体快速检测方法的建立及应用［J］.吉林大学学报(医学版)，2010，36(4):797-802.

［13］白剑，肖漓，石炳毅.器官移植术后人巨细胞病毒感染的实验室诊断研究进展［J］.中国误诊学杂志，2008，8(12):2791-2793.

［14］闫淑嫒，陈平洋.人巨细胞病毒感染的实验室诊断研究进展［J］.国外医学(儿科学分册)，2005，32(5):284-287.

［15］Das S，Ram achandran VG，Arora R.Cytomegalovirus and rubella infection in children and pregnantmothers a hospital based study［J］.J Commun Dis，2007，39(2):113-117.