EPA对草鱼前体脂肪细胞增殖分化的影响

刘 品 吉 红 李 超 黄吉芹 Marijana Todorčević

(1.西北农林科技大学动物科技学院, 杨凌 712100; 2.挪威水产养殖、渔业与食品综合研究所, 卑尔根 P.O.Box 5010)

高不饱和脂肪酸脂肪酸(Highly unsaturated fatty acid, HUFA)是指具有 20个以上碳原子, 并含有两个或两个以上不饱和键的脂肪酸, 主要包括二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid, EPA)和二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid, DHA)。诸多学者采用离体细胞培养体系进行研究发现, HUFA可影响哺乳动物脂肪细胞发育[1—4]。李惠侠等[3]指出 DHA可抑制大鼠前体脂肪细胞的增殖和分化, 并下调脂肪特异性分化转录因子—过氧化物酶体增殖激活受体 γ(Peroxisome proliferator activiated receptor γ,PPARγ)mRNA的表达量。Kim,et al.[4]也发现DHA可抑制3T3-L1脂肪细胞分化, 促进脂肪细胞水解, 并诱导细胞凋亡。

尽管HUFA并非草鱼的必需脂肪酸, 但已有研究证实其对草鱼的脂质代谢有着显著的影响, 且该方面的研究多采用在体的方式[5—9]。如吉红等[8,9]用富含 EPA和 DHA的日粮饲喂草鱼, 发现其可抑制草鱼脂质合成并减少脂质向肝脏组织的转运, 最终降低肝胰脏脂肪及腹腔脂肪的沉积。近年来, 随着鱼类脂肪细胞培养体系的建立[10—13], 采用离体模型进行脂质代谢的研究也逐渐增多[14—17]。Todorčević,et al.[14]用不同脂肪酸处理大西洋鲑前体脂肪细胞发现, EPA可显著降低脂肪细胞蓄积甘油三酯的能力。而EPA对草鱼脂肪细胞影响的研究尚未见报道。

为了深入探究HUFA对草鱼脂质代谢的影响及其机理, 在本实验室已建立的草鱼脂肪细胞培养体系基础上, 研究了EPA对体外培养的草鱼脂肪细胞增殖分化及相关基因表达的影响, 以期为草鱼HUFA营养机理研究提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验动物 体重1 kg左右健康草鱼, 购于杨凌康乐市场。

主要试剂 DMEM/F12固体培养基(Gibco),胎牛血清(四季青)、Ι型胶原酶(Gibco) 、牛血清白蛋白(Gibco)、无脂肪酸牛血清白蛋白(北京经科宏达生物技术有限公司)、牛胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、氢化可的松、油红O、MTT、EPA均购自Sigma公司, 碳酸氢钠、无水乙醇等化学试剂均为国产分析纯。反转录试剂盒及荧光定量试剂盒购自TaKaRa公司。

1.2 试验方法

草鱼前体脂肪细胞获得及培养 试验鱼在水族箱中停食暂养1d左右。试验前将鱼敲晕后剪断鳃弓放血, 清洗干净并用75%酒精擦拭鱼体进行消毒,无菌环境中解剖取出腹腔肠系膜脂肪组织, 将其放入含 5%牛血清白蛋白的 PBS缓冲液中, 并称量记录分离的脂肪组织总重量。

将取出的脂肪组织用PBS冲洗3次后放入烧杯,加入等体积的0.1% Ι型胶原酶消化液, 剪碎组织的同时对组织进行消化, 15min后用含有20%胎牛血清的培养液终止消化反应。随后将混合液放于50 mL离心管, 800 g离心10min, 弃上层液体, 用不含胎牛血清的DMEM/F12培养基将沉淀的细胞重悬, 吹打均匀, 将细胞悬浮液通过 200目的尼龙网过滤, 收集滤液, 800 g离心10min, 弃上层液体, 加入20 mL红细胞裂解液, 静置5min, 800 g离心5min, 弃去上清。将获得的草鱼前体脂肪细胞用不含血清的培养液重悬清洗, 800 g离心5min, 重复两次后用含20%胎牛血清的基础培养基将细胞重悬, 以10 g/25 cm2密度接种于预先用 1%明胶涂布板底的培养板内,于28℃, 5% CO2条件下进行培养, 隔天换液并观察细胞增殖发育情况。当细胞生长至汇合阶段(接种6d), 给细胞换诱导培养基继续培养, 具体流程(图1)。

MTT法检测草鱼前体脂肪细胞增殖 按照前述方法获得草鱼前体脂肪细胞并培养, 待细胞贴壁后, 分别用加有0、50、100 μmol/L EPA的基础培养基进行处理, 处理1、2、3和4后通过MTT比色测定草鱼前体脂肪细胞增殖活性。每孔加入 20 μL新鲜配制的MTT溶液, 28℃继续培养4h后终止培养,弃去孔内培养液, 每孔加 150 μL DMSO, 震荡10min。波长490 nm处, 以经过相同处理的无细胞孔作为空白进行调零, 在全波长酶标仪(Gene, USA)上测定各孔OD值。

油红O染色提取法检测草鱼前体脂肪细胞分化按照前述方法培养细胞, 待细胞增殖达到80%以上汇合后, 将基础培养基换为诱导培养基, 并在诱导培养基中分别加入0、50、100 μmol/L EPA, 分别取诱导分化1、3和5d的细胞, 各孔细胞用PBS洗3次, 10%甲醛溶液固定30min后, 用PBS洗2次, 红油O染色液浸染10min, PBS洗2次, 异丙醇分色20s,倒置显微镜下观察细胞内脂滴染色情况并拍照。随后每孔加入1 mL异丙醇, 恒温摇床内震荡10min以萃取被染细胞中的油红 O, 以相同处理的无细胞孔作为空白调零, 紫外分光光度计(岛津UVmini 1240,Japan)500 nm波长处比色, 记录OD值。

Real-time qPCR检测基因表达情况 当细胞增殖到80%汇合时(接种6d)分别用0、100 μmol/L EPA处理。2d后吸弃培养液, 室温下PBS洗涤2—3次, 提取RNA, 取1 μg总RNA进行反转录, 方法参照 TakaRa公司的 PrimeScript®RT reagent Kit (Perfect Real Time)说明书。实时定量检测采用CFX-96实时定量 PCR检测系统(Bio-Rad, USA)进行, 反应体系为 20 µL, 包括： 10 mmol/μL 的上下游引物各 0.6 μL、1 μL cDNA、10 μL 2×SYBR®Premix ExTaq™ II S、7.8 μL 灭菌水。反应条件为： 95℃, 10s; 95℃, 15s; 57℃,15s; 40个循环。根据扩增曲线得到的Ct值(荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数), 计算出目标基因与内参基因β-actinCt值的差异ΔCt, 计算出不同样品相对于内参基因表达倍数 2−ΔCt, 从而制作相对定量的图表。基因检测实时定量引物(表1)。

图1 草鱼前体脂肪细胞体外培养模式图Fig.1 Summary of grass carp preadipocytes development

表1 实时定量检测引物列表Tab.1 Primers used for quantitative real-time PCR

1.3 数据分析

所得数据用平均值±标准差(Mean±SD)表示。采用 SPSS13.0软件中单因素方差分析(One-way ANOVA)和t检验对所得数据进行显著性检验分析,当P<0.05时, 认为差异显著。

2 结果

2.1 草鱼前体脂肪细胞发育过程

草鱼前体脂肪细胞接种第1天(图2A), 隔天换液, 培养第 4天可见贴壁细胞伸展呈梭形, 并开始形成草鱼前体脂肪细胞增殖群落(图2B), 接种6d后,前体脂肪细胞大量增殖, 可覆盖培养皿底面积 80%(图 2C), 此时换成诱导培养液继续培养。接种 14d(诱导培养 8d)部分细胞分化完全, 胞内形成若干大脂滴(图 2D)。

2.2 EPA对草鱼前体脂肪细胞增殖的影响

从表2中可以看出, 50 μmol/L EPA处理脂肪细胞2d内可显著促进细胞的增殖(P<0.05), 但是从3d起其促进作用消失(P>0.05), 到第4天转为抑制作用(P<0.05); 100 μmol/L EPA组在前3天始终对草鱼前体脂肪细胞的增殖起到显著的促进作用(P<0.05),到第4天促进作用消失(P>0.05)。

2.3 EPA对草鱼前体脂肪细胞分化的影响

EPA对草鱼前体脂肪细胞脂质蓄积能力的影响在草鱼前体脂肪细胞分化第 1天, 分别用含 50 μmol/L和100 μmol/L EPA的培养液孵育处理细胞1d后, 通过油红O脂滴特异染色后发现, 细胞内被油红O染成亮红色的脂滴数与充脂细胞数减小较对照组减少(图 3)。油红 O染色提取法比色法(以 OD值表示)定量分析细胞内脂质的生成量, 结果表明,EPA处理 1d可显著降低细胞内的脂质生成量(P<0.05, 图 4)。但是随着处理时间的延长, EPA对草鱼前体脂肪细胞分化的抑制效果逐渐减弱, 处理组脂滴数量与大小逐渐赶上对照组。并且, 处理组脂质含量测定结果也与对照组相近(P>0.05)(图4)。

EPA对草鱼前体脂肪细胞分化初期脂代谢相关基因表达的影响 如图5所示, 100 μmol/L EPA处理脂肪细胞2d后, 显著促进了细胞LPL和PGC-1α基因的表达(P<0.05), 而对PPARs家族基因的表达无显著性影响(P>0.05, 图5)。

3 讨论

脂肪组织发育的实质是脂肪细胞数目的增加和体积的增大, 而脂肪细胞由不含大脂滴的前体脂肪细胞发育为储存脂质的成熟脂肪细胞受到许多因子调控。EPA和 DHA是鱼油中最主要的多不饱和脂肪酸, 它们均具有抑制动物体甘油三酯合成的作用。研究表明, EPA可改善肥胖及肥胖相关的疾病如胰岛素抵抗、Ⅱ型糖尿病和心血管疾病, 提高脂肪组织、肝脏和肌肉组织的胰岛素敏感性, 并促进葡萄糖利用[18,19]; DHA可剂量和时间依赖性地降低3T3-L1前体脂肪细胞和原代培养的大鼠前体脂肪细胞的增殖活力[1,2]。本研究则首次探讨了 EPA在离体条件下对草鱼脂肪细胞发育的影响, 发现 EPA处理前2d可显著促进细胞增殖, 但是到增殖的第4天 50 μmol/L处理组呈现出显著抑制作用, 这一现象与DHA在3T3-L1及大鼠上的作用存在差异, 表明不同种类脂肪酸对于脂肪细胞增殖的影响可能存在不同的调节机制。相关研究尚需进一步进行。

表2 MTT检测EPA对草鱼前体脂肪细胞增殖的影响Tab.2 Effects of EPA on preadipocytes proliferation of grass carp by MTT assay

前体脂肪细胞分化是甘油三酯沉积的过程, 涉及一系列的转录事件。PPARs家族的三个成员(PPARα、PPARβ、PPARγ)在脂肪细胞脂肪酸代谢中发挥着重要的作用。PPARα主要在脂肪酸的氧化代谢中发挥重要作用, 但是它在白色脂肪细胞中的表达量较低; PPARγ则在细胞的脂质生成过程中发挥关键的作用, 在白色脂肪细胞中得表达量较高; PPARβ在脂肪组织代谢和能量的动态平衡发挥着重要作用[20]。Chambrier,et al.[21]在人的脂肪细胞上研究发现EPA可显著促进PPARγ表达, 但Yoshiyuki,et al.[22]对 3T3-L1的研究发现了相反的结果,且没有对分化造成影响。Manickam,et al.[23]则指出EPA可显著降低脂肪细胞脂滴的大小以及脂质含量。在本研究中, EPA没有影响PPARs家族3个成员的表达, 但却在分化初期显著抑制了草鱼脂肪细胞蓄积甘油三酯的能力(图 4), 与 Manickam,et al.[23]在 3T3-L1上的研究结果一致。

另一方面, 本研究发现 EPA显著促进了脂质分解基因LPL和线粒体生成相关基因PGC-1α的表达(图5)。LPL是脂肪细胞平衡脂质生成与分解的限制酶[24]。Todorčević,et al.[25]研究发现LPL在大西洋鲑前体脂肪细胞发育过程中相对于接种第 1天呈现先升高后降低最后又升高的波动趋势, 在细胞增殖过程中LPL表达升高, 细胞汇合后至细胞分化中期LPL表达降低, 细胞分化后期LPL表达升高。在本试验中,在草鱼前体脂肪细胞分化初期, EPA促进了LPL的表达, 表明EPA可能通过LPL促进了细胞的脂质分解从而降低了细胞脂质的蓄积能力。Manickam,et al.[23]的研究表明EPA可上调3T3-L1脂肪细胞LPL和HSL等基因的表达, 并抑制脂肪细胞的分化。Mak-Soon,et al.[26]则发现EPA可通过上调脂质分解基因和下调脂质合成基因促进 3T3-L1脂肪细胞的脂质分解。另一方面, 也有研究表明摄入鱼油可促进人和小鼠脂肪组织LPL基因的表达[27,28], 本研究结果与之一致。以上结果表明, EPA有可能通过促进脂肪细胞的脂质分解进而抑制脂肪细胞的脂质蓄积。

PGC-1α参与调控线粒体的生成[29]、适应性产热、线粒体生成、肝脏脂肪酸β氧化、脂肪细胞分化等多种代谢过程[30], 在调节能量代谢中发挥着重要的作用。PGC-1α在有高能量需求及线粒体丰富的组织中表达水平相对较高, 而在白色脂肪细胞表达极少[31]。Lu,et al.[32]研究发现PGC-1α在猪的前体氧化代谢基因核呼吸因子(Nuclear respiratory factor-1,Nrf-1)的表达。本实验室曾报道饲喂HUFA可显著促进草鱼肝脏PGC-1α基因的表达[34], 且肝脏脂质含量也显著下降。有学者在人的脂肪细胞中超表达PGC-1α, 结果致使脂肪细胞储能作用变成能量耗散作用[35]。在本实验中 EPA促进了脂肪细胞PGC-1α基因的表达, 同时发现 EPA处理组细胞的脂质含量显著低于对照组, 推测PGC-1α的表达升高促进了细胞线粒体的增殖发育, 进而促进细胞对脂肪酸的氧化分解, 最终通过抑制脂肪细胞脂质生成降低脂质蓄积。

图2 草鱼前体脂肪细胞发育过程图Fig.2 Morphology of grass carp preadipocytes development

图3 EPA对草鱼脂肪细胞分化过程中形态的影响Fig.3 Morphological changes of grass carp adipocytes treated with EPA

图4 EPA对草鱼前体脂肪细胞分化的影响Fig.4 Effects of EPA on differentiation of grass carp preadipocytes by Oil Red O extraction

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