JunB在实验性支气管哮喘中的作用

李海燕，郭琦，陈如冲，周一平，李明，喻海琼，江梅

(1.广东医学院附属福田医院社康部，广东深圳518033；2.广东医学院附属福田医院呼吸科，广东深圳518033；3.广州呼吸疾病研究所(呼吸疾病国家重点实验室)，广东广州510120)

·论著·

JunB在实验性支气管哮喘中的作用

李海燕1*，郭琦2*，陈如冲3，周一平2，李明2，喻海琼2，江梅3

(1.广东医学院附属福田医院社康部，广东深圳518033；2.广东医学院附属福田医院呼吸科，广东深圳518033；3.广州呼吸疾病研究所(呼吸疾病国家重点实验室)，广东广州510120)

目的探索激活蛋白-1(Activator protein-1，AP-1)家族成员中参与构成哮喘病理生理特征的关键亚单位，为哮喘治疗提供更精确和新颖分子靶点。方法建立大鼠哮喘模型。130只雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组、哮喘空白组、c-Jun反义寡核苷酸(Antisense oligodeoxynucleotides，AS-ODNs)组、JunB AS-ODNs组、JunD AS-ODNs组、c-Fos AS-ODNs组、FosB AS-ODNs组、Fra-1 AS-ODNs组、Fra-2 AS-ODNs组和无义寡核苷酸(Nonsense ODNs，NS-ODNs)组。实施基因沉默后，HE染色计数支气管肺泡灌洗液中嗜酸粒细胞(Eosinophils，EOS)百分比，逆转录-聚合酶链反应检测白介素(Interleukin，IL)-5 mRNA表达。结果JunB AS-ODNs组的EOS百分比[(13.39±3.72)%]显著低于哮喘空白组[(34.33±9.62)%]，差异有统计学意义(P＜0.001)，但仍高于正常对照组[(5.61±1.76)%]，差异有统计学意义(P＜0.05)。其余ODNs组的EOS百分比与哮喘空白组的差异均无统计学意义(P＞0.05)。与哮喘空白组比较，JunB AS-ODNs组的IL-5 mRNA表达被显著抑制[(0.554 2±0.082 9)vs(0.822 4±0.066 0)，P＜0.001]，但亦仍高于正常对照组[(0.323 7±0.057 7)，P＜0.001]。其余ODNs组IL-5 mRNAs表达与哮喘空白组比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。结论在转录因子AP-1家族中，JunB亚单位可能决定哮喘大鼠气道慢性炎症，可能是新颖治疗靶点。

激活蛋白-1；亚单位；反义寡核苷酸；支气管哮喘

近40年来，哮喘发病率、病死率和经济负担急剧上升，尤其在儿童中。全球目前大约3亿人患有哮喘，且其流行趋势是每10年增加50%[1]。尽管发布了2012年全球哮喘防治创议(Global initiative for asthma，GINA)更新版，但用于治疗的控制剂和缓解剂尚无本质突破。

哮喘气道炎症的中心效应细胞是Th2细胞[2]。激活蛋白-1(Activator protein-1，AP-1)调节Th2细胞因子白介素(Interleukin，IL)-5表达[3]。AP-1活化失调导致临床糖皮质激素抵抗型哮喘[4]。AP-1是变应性气道炎症的重要治疗靶点[5]。我们以往的研究揭示：AP-1顺式诱骗元件能在体外显著抑制佛波醇肉豆蔻酸盐(Phorbol myristate acetate，PMA)诱导的哮喘大鼠和哮喘患者外周血T细胞AP-1核转位和IL-5转录[6-7]。Desmet等[8]亦证实该顺式诱骗元件能显著抑制实验性哮喘所有病理生理特征，即嗜酸性粒细胞性气道炎症、气道高反应性、黏液细胞增生、变应原特异性免疫球蛋白分泌、Th2细胞因子(IL-4、IL-5和IL-13)和eotaxin的合成。AP-1是由Jun(c-Jun、JunB和JunD)和Fos(c-Fos、FosB、Fra-1和Fra-2)亚单位组成的二聚体蛋白[9]。AP-1分布有其细胞特异性。每个家族成员间的功能有重叠而能相互代偿，但它们能介导特异而互不重叠的功能[10]。干预AP-1某个亚单位，可能既能抑制哮喘诸多病理生理特征，又不至于过多破坏组织和器官稳态。

本文选用大鼠哮喘模型，通过基因沉默技术，探索AP-1家族成员中参与构成哮喘病理生理特征的关键亚单位，为哮喘治疗提供更精确和新颖分子靶点，并初步揭示该亚单位参与哮喘发病的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物来源及分组130只健康雄性Wistar大鼠(体重为200～250 g)由广东省实验动物医学中心提供。随机分为正常对照组、哮喘空白组、c-Jun反义寡核苷酸(Antisense oligodeoxynucleotides，AS-ODNs)组、JunB AS-ODNs组、JunD AS-ODNs组、c-Fos AS-ODNs组、FosB AS-ODNs组、Fra-1 AS-ODNs组、Fra-2 AS-ODNs组和无义寡核苷酸(nonsense ODNs，NS-ODNs)组，每组13只。

1.2 试剂卵清蛋白(ovalbumin，OVA)、TRIzo试剂、逆转录-聚合酶链反应试剂盒均购于Sigma-Aldrich公司。全链硫代修饰的ODNs和引物由上海生工生物工程有限公司合成。c-Jun AS-ODNs [X17163(gi:57819)]：5'-TTCCATCTTTGCAGTCAT-3'。JunB AS-ODNs[NM_021836(gi:40254774)]：5'-TTCCATTTTCGTGCACAT-3'。JunD AS-ODNs[NM_138875 (gi:58761523)]：5'-ATAGAGGGCGTTTCCAT-3'。c-FosAS-ODNs[X06769(gi:55933)]：5'-GAAACCCGAGAACATCAT-3'。FosB AS-ODNs[NM_001013146(gi: 61557093)]：5'-GGGATAATCCTGGTACAT-3'。Fra-1 AS-ODNs[M19651(gi:204174)]：5'-CCCGAAGTCTCGGTACAT-3'。Fra-2AS-ODNs[U18913(gi:1001950)]：5'-GGGATAATCCTGGTACAT-3'。NS-ODNs:5'-CCCTTATTTACTACTTTC-3'。

1.3 大鼠哮喘模型建立[11]第一天在大鼠后腿内侧皮下注射OVA 10 mg和氢氧化铝200 mg(溶于1 ml生理盐水中)，同时腹腔注射5×109个/ml灭活的百日咳杆菌疫苗1 ml(作为佐剂)。致敏2周后开始激发：将大鼠置于特制密闭玻璃盒中，雾化吸入2% OVA生理盐水50 ml，1次/d，30 min/次，连续7 d。以出现烦躁、呛咳、呼吸加快及轻度紫绀等典型的哮喘发作症状为激发成功标准。正常对照组则以生理盐水代替OVA，余同上。

1.4 基因沉默除外正常对照组和哮喘空白组，激发7 d后每组每天在麻醉状态下分别从大鼠鼻腔内滴入2 μg/μl c-Jun、JunB、JunD、c-Fos、FosB、Fra-1和Fra-2AS-ODNs及NS-ODNs各100μl，共7d。

1.5 标本采集最后1次激发后24 h内，20%乌拉坦麻醉大鼠。暴露气管，气管插管，结扎右肺，行左肺灌洗。每次注入3 ml生理盐水，回收率约为80%，重复进行3次。收集支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid，BALF)。取出右肺并冻存于-70℃冰箱。

1.6 嗜酸粒细胞(Eosinophils，EOS)计数所收集BALF在4℃下离心10 min，沉淀经(Haematoxylin-eosin)HE染色，连续计数200个细胞及其中EOS数，得EOS百分比。

1.7 RNA提取和RT-PCR取50～100 mg新鲜肺组织，按试剂说明书操作，采用TRIzol试剂一步法提取总RNA，逆转录为cDNA，以此为模板行PCR扩增。PCR引物：(1)IL-5[X54419(gi:313254)]上游引物：5'-TGAGGATGCTTCTGTGCTTG-3'(510/529)，下游引物：5'-GACTTCCATTGCCCACTCTG-3'(885/ 904)，扩增产物为395 bp。(2)磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde3-phosphate dehydrogenase，GAPDH) [X02231(gi:56187)]上游引物：5'-GTGCTGAGTATGTCGTGGAG-3'(337/356)，下游引物：5'-GTCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3'(606/625)，扩增产物为289 bp。PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸45 s；35个循环；72℃延伸10 min。未逆转录的总RNA作为阴性对照，以排除基因组DNA污染。DEPC水取代RNA作为试剂对照。1.5%琼脂糖凝胶电泳。GDS 800型凝胶成像分析系统(美国UVP公司)分析扩增产物条带，分别测定各扩增带A值，将目的基因IL-5扩增带与内参照GAPDH扩增带的A值比作为其mRNA水平的定量指标。

1.8 统计学方法数据录入后，转到SPSS13.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差(x-±s)表示。采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 气道炎症哮喘空白组BALF中的EOS百分比[(34.33±9.62)%]显著高于正常对照组[(5.61± 1.76)%]，差异有统计学意义(P＜0.001)。与哮喘空白组比较，JunB AS-ODNs组的EOS百分比[(13.39± 3.72)%]显著减少，差异有统计学意义(P＜0.01)，但仍高于正常对照组，差异亦有统计学意义(P＜0.001)。其余ODNs组的EOS百分比与哮喘空白组的差异均无统计学意义(P＞0.05)，见图1。

图1 BALF中EOS百分比

2.2 肺组织IL-5转录与正常对照组比较，哮喘空白组IL-5 mRNA表达显著增加(P＜0.001)。 JunB AS ODNs组的IL-5 mRNA表达低于哮喘空白组，其差异有统计学意义(P＜0.001)；但亦仍高于正常对照组，且其差异亦有统计学意义(P＜0.001)。其余ODNs组IL-5 mRNAs表达与哮喘空白组比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。见表1和图2。

表1 肺组织IL-5 mRNA表达

表1 肺组织IL-5 mRNA表达

注：与正常对照组比较，aP＜0.001；与哮喘空白组比较，bP＞0.05，cP＜0.001

组别正常对照组哮喘空白组c-JunAS ODNs组JunBAS-ODNs组JunDAS-ODNs组IL-5 mRNA(A值比) 0.323 7±0.057 7 0.822 4±0.066 0a0.799 0±0.075 8ab0.554 2±0.082 9ac0.787 0±0.071 9ab组别c-FosAS-ODNs组FosBAS-ODNs组Fra-1AS-ODNs组Fra-2AS-ODNs组NS-ODNs组IL-5 mRNA(A值比) 0.817 9±0.068 8ab0.814 6±0.064 2ab0.788 8±0.067 8ab0.810 4±0.064 6ab0.821 2±0.072 1ab

图2 肺组织IL-5 mRNA表达

3 讨论

沉默JunB基因后，BALF中的EOS百分比显著降低，IL-5 mRNA表达被显著抑制，而其余亚单位组均未见此效果。同是AP-1家族成员，JunB在IL-5基因转录中不可替代性的原因尚待进一步探讨。这有利于提高对广泛存在的迷人的转录因子AP-1的理解和进一步阐明哮喘发病的分子机制。

实验所选用的AS-ODNs与目的基因mRNAs翻译起始序列互补，能与mRNA构成双链而阻断信息翻译,并具有RNA酶H活性而降解靶RNA[12-14]。AS-ODNs技术为抑制某一特定基因的表达提供了极其特异和快速的方法，适宜于研究细胞内信号转导，优于信号分子的药理学抑制剂[14]。

Hartenstein等[15]采用转基因小鼠，并获取JunB缺失的CD4+T细胞。在Th2极化培养条件下，经刀豆蛋白A和抗CD3抗体/抗CD28抗体刺激后，与对照组比较，IL-4和IL-5表达显著减少(尤其是后者)，而IL-13表达的变化不明显，Th1细胞因子干扰素-γ的表达增加。雾化吸入OVA以激发OVA所致敏小鼠，采用HE染色检测EOS浸润和PAS(Periodic acid-Schiff)染色检测黏液分泌，与对照组比较，JunB缺失小鼠细支气管周围EOS浸润几乎完全缺失、血管周围仅见少许EOS、大部分小支气管中分泌黏液的杯状细胞减少、黏液分泌显著减少。我们的研究结果与其相似，并且对7个AP-1亚单位基因进行筛选，发现仅JunB基因沉默能显著抑制哮喘大鼠慢性气道炎症和IL-5 mRNA表达。

尽管JunB基因沉默效果显著，但检测指标仍显著高于正常对照组。一则可能是AS-ODNs技术本身尚不完善(如反义序列位点的选择、防止被核酶所降解的方法、AS-ODNs长度而非序列依赖的与含聚阴离子结合位点蛋白结合的能力)，二则可能是c-Jun或JunD在一定程度上可替代JunB而与Fos家族成员构成异源二聚体。

Schwenger等[16]选用人T细胞系PER-117细胞，经PMA刺激后，八聚体(Octamer，Oct)-1、Oct-2和AP-1(JunD/Fra-2)结合IL-5启动子CLEO元件。新合成的Fra-2是IL-5分泌限速因子。共转染人IL-5启动子报道质粒和反义核酸质粒后，发现反义Fra-2对IL-5表达的抑制达到75%，而反义JunD则无此影响。人离体T细胞中调控IL-5表达的AP-1亚单位与鼠类不一致，在人肺组织中的情况有待于人肺组织中AP-1亚单位基因筛选研究。

变态反应、气道慢性炎症、气道高反应性和气道重构是哮喘重要病理生理特征。JunB基因沉默后，可否同时显著抑制上述四项特征有待深入研究。这有助于揭示该亚单位参与哮喘发病的机制。

综上所述，JunB亚单位可能决定哮喘大鼠气道慢性炎症，可能是新颖治疗靶点。

(志谢：衷心感谢广东医学院附属福田医院检验医学部陈晓燕博士后为此研究所作出的贡献。)

[1]Braman SS.The global burden of asthma[J].Chest,2006,130(1 Suppl):4-12.

[2]Woodruff PG,Fahy JV.Asthma:prevalence,pathogenesis,and prospects for novel therapies[J].JAMA,2001,286(4):395-398.

[3]Wang J,Young IG.Eosinophilic inflammation:mechanisms regulating IL-5 transcription in human T lymphocytes[J].Allergy,2007, 62(10):1131-1138.

[4]Loke TK,Mallett KH,Ratoff J,et al.Systemic glucocorticoid reduces bronchial mucosal activation of activator protein 1 components in glucocorticoid-sensitive but not glucocorticoid-resistant asthmatic patients[J].JAllergy Clin Immunol,2006,118(2):368-375.

[5]Nguyen C,Teo JL,Matsuda A,et al.Chemogenomic identification of Ref-1/AP-1 as a therapeutic target for asthma[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(3):1169-1173.

[6]郭琦,徐永健,张珍祥.蛋白激酶C和激活蛋白-1信号级联对哮喘大鼠IL-5基因转录的调控作用[J].中华微生物学和免疫学杂志,2005,25(5):388-392.

[7]Guo Q,Xu Y,Zhang Z.Role of activator protein-1 in the transcription of interleukin-5 gene regulated by protein kinase C signal in asthmatic human T lymphocytes[J].J Huazhong Univ Sci Technology Med Sci,2005,25(2):147-150.

[8]Desmet C,Gosset P,Henry E,et al.Treatment of experimental asthma by decoy-mediated local inhibition of activator protein-1[J]. Am J Respir Crit Care Med,2005,172(6):671-678.

[9]Shaulian E,Karin M.AP-1 as a regulator of cell life and death[J]. Nat Cell Biol,2002,4(5):131-136.

[10]Chinenov Y,Kerppola TK.Close encounters of many kinds:Fos-Jun interactions that mediate transcription regulatory specificity[J].Oncogene,2001,20(19):2438-2452.

[11]Waserman S,Xu LJ,Olivenstein R,et al.Association between late allergic bronchoconstriction in the rat and allergen-stimulated lymphocyte proliferation in vitro[J].Am J Respir Crit Care Med,1995, 151(2 Pt 1):470-474.

[12]Wagner RW.Gene inhibition using antisense oligodeoxynucleotides [J].Nature,1994,372(6504):333-335.

[13]Stein CA,Cheng YC.Antisense oligonucleotides as therapeutic agents—Is the bullet really magical?[J].Science,1993,261(5124): 1004-1015.

[14]Avraham H,Avraham S,Zagozdzon R.Use of antisense oligonucleotide technology to investigate signaling pathways in megakaryocytes[J].Methods Mol Biol,2004,273:397-406.

[15]Hartenstein B,Teurich S,Hess J,et al.Th2 cell-specific cytokine expression and allergen-induced airway inflammation depend on JunB [J].EMBO J,2002,21(23):6321-6329.

[16]Schwenger GT,Kok CC,Arthaningtyas E,et al.Specific activation of human interleukin-5 depends on de novo synthesis of an AP-1 complex[J].J Biol Chem,2002,277(49):47022-47027.

Role of JunB in experimental bronchial asthma

LI Hai-yan1*,GUO Qi2*,CHEN Ru-chong3,ZHOU Yi-ping2,LI Ming2,YU Hai-qiong2,JIANG Mei3.1.Department of Primary Care,Futian Hospital Affiliated to Guangdong Medical College,Shenzhen 518033,Guangdong,CHINA;2.Department of Respiratory Medicine,Futian Hospital Affiliated to Guangdong Medical College,Shenzhen 518033,Guangdong,CHINA;3.Guangzhou Institute of Respiratory Diseases (State Key Laboratory of Respiratory Diseases),Guangzhou 510120,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo determine the key activator protein-1(AP-1)subunit involved in the characteristics of the pathophysiology of asthma,in order to provide more accurate and novel molecular targets for the treatment of asthma.MethodsAsthmatic rat models were employed.One hundred and thirty Wistar male rats were randomly divided into normal control,blank control,c-Jun antisense oligodeoxynucleotides(AS-ODNs),JunB AS-ODNs,JunD AS-ODNs,c-Fos AS-ODNs,FosB AS-ODNs,Fra-1 AS-ODNs,Fra-2 AS-ODNs,and nonsense ODNs groups.After gene silencing,the percentages of eosinophils(EOS)in the bronchoalveolar lavage fluid were calculated using haematoxylin-eosin staining,and interleukin(IL)-5 mRNA was detected by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR).ResultsThe percentage of EOS in JunB AS-ODNs group was decreased significantly as compared with that in the blank control[(34.33±9.62)%vs(13.39±3.72)%,P＜0.001],but was still higher than that in the normal control[(5.61±1.76)%,P=0.04].No significant differences in the percentages of EOS between other ODNs groups and the blank control were observed(P＞0.05).Compared with that in the blank control,the expression of IL-5 mRNA in JunB AS-ODNs group was markedly suppressed[(0.554 2±0.082 9)vs(0.822 4±0.066 0),P＜0.001],which was also still higher than that in the normal control[(0.323 7±0.057 7),P＜0.001].There were no significant differences in the expression of IL-5 mRNA between other ODNs groups and the blank control(P＞0.05).ConclusionChronic airway inflammation in asthmatic rats might depend on JunB,one of the subunits in the family of transcription factor AP-1.JunB might be a novel therapeutic target in asthma.

Activator protein-1(AP-1);Subunits;Antisense oligodeoxynucleotides;Bronchial asthma

R562.2+2

A

1003—6350（2013）06—0781—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2013.06.0336

2013-01-07)

广东省医学科学技术研究基金(编号：A2009621)；深圳市科技计划重点项目(编号：200901023)、福田区公益性科研项目(编号：FTWS201040)

*同等贡献作者

郭琦。E-mail:qiguo88@hotmail.com