绵羊肺腺瘤病毒NM株囊膜蛋白的二级结构及其B 细胞抗原表位预测

刘 月，张宇飞，张亚坤，孙晓林，刘淑英，2＊

（1.内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古呼和浩特010018；2.农业部动物临床诊疗技术重点实验室，内蒙古呼和浩特010018）

绵羊肺腺瘤病毒（Ovine pulmonary adenocarinoma，OPAV）是绵羊肺腺瘤（Ovine pulmonary adenomatosia，OPA）的病原，主要侵害肺脏［1-3］。该病的一个重要特点是，由于与外源性绵羊肺腺瘤病毒高同源性的内源性绵羊肺腺瘤病毒的存在，在OPA病羊体内未曾检测到OPAV的循环抗体而不能用常规的血清学方法进行诊断，因此抗原的检测尤为重要［4-6］。env基因编码反转录病毒的囊膜蛋白，位于反转录病毒粒子的表面，许多逆转录病毒的囊膜存在可产生中和性抗体的特异性抗原［7-8］。绵羊肺腺瘤病毒是反转录病毒科β反转录病毒属的成员之一，囊膜蛋白ENV在病毒粒子的表面，这一位置更利于囊膜蛋白的检测［9］。抗体是由B淋巴细胞增殖分化成的浆细胞所产生的，可与相应抗原发生特异性结合。本文旨在基于已获得的绵羊肺腺瘤病毒NM株env基因序列的基础上，通过生物信息学分析绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白的B细胞抗原表位，然后再筛选出具有合适优势表位的候选抗原，为研制有效的疫苗和制备特异的检测抗体提供参考，对绵羊肺腺瘤的防控和检测具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

OPAV-NM囊膜蛋白的氨基酸来自于Gen-Bank，序列登录号为JQ837489。

1.2 方法

1.2.1 OPAV-NM囊膜蛋白二级结构的预测 应用 Gamier＿Robson（http：／／fasta.bioch.virginia.edu／fasta-www2／fasta-www.cgi？rm=misc1）方法、SOPMA（http：／／npsa-pbil.ibcp.fr）方法和网络服 务 器 PSIPRED （http：／／bioinf.cs.ucl.ac.uk／psipred）、Predictprotein （http：／／www.predictprotein.org）预测OPAV-NM囊膜蛋白的二级结构。

1.2.2 OPAV-NM囊膜蛋白B细胞抗原表位的预测 利用DNA Star软件的Protean模块，用Kyte-Doolittle方法对囊膜蛋白的疏水性进行分析，用Emini方法预测囊膜蛋白的表面可能性，用Karplus-Schulz方法预测囊膜蛋白的柔性区域，以Jameson-Wolf方法综合预测囊膜蛋白的B细胞抗原指 数。用 网络服务 器 Bcepred（http：／／www.imtech.res.in／raghava／bcepred／bcepred-submission.html），IEDB （http：／／tools.immuneepitope.org／）和 ABCpred（http：／／www.imtech.res.in／raghava／abcpred／ABC-submission.html）预测囊膜蛋白的B细胞线性抗原表位。

2 结果

2.1 OPAV-NM囊膜蛋白氨基酸序列分析

利用DNA Star软件分析推导的OPAV-NM囊膜蛋白氨基酸序列与外源OPAV21（AF105220）、OPAVJS7（AF357971.1） 和 内 源 enOPAV-20（EF680302）的囊膜蛋白氨基酸同源性分析和序列比对。虽然OPAV-NM囊膜蛋白氨基酸序列为与enOPAV-20的同源性高达95.2%，但仍存在一个明显的差异区段，为第548TLLGLGILVFIIIVVILIFPCLVRGMVRDFLKMRVEMLHMKYR591位氨基酸，该区段的enOPAV-20氨基酸序列有一段明显的氨基酸序列缺失，也没有外源性绵羊肺腺瘤病毒特有的YXXM基序（图1）。

图1 AF105220、AF357971、EF680302与OPAV-NM囊膜蛋白氨基酸同源性分析与序列比对Fig.1 The amino acid homology analysis and sequence distances of envelope protein of between AF105220，AF357971，EF680302and OPAV-NM

2.2 OPAV-NM囊膜蛋白二级结构的预测

Gamier-Robson方法是通过计算特定氨基酸残基在特定结构内部的可能性来预测蛋白质二级结构［10］。用该方法预测OPAV-NM囊膜蛋白二级结构，在615个氨基酸中α螺旋占29.5%，β折叠占32.21%和β转角占21.7%和无规则卷曲占19.2%个氨基酸，说明其二级结构丰富，且分布相对均匀，在各β折叠单元之间存在长短不一的转角（图2A）。SOPMA是通过多序列比对来预测蛋白质的二级结构［11］。预测α螺旋占45.2%，β折叠占18.05%，β转角占3.09%，无规则卷曲占33.66%（图2B）。Predictprotein服务网站是欧洲分子生物实验室提供的蛋白质序列和结构预测服务网站，采用PHD神经网络法预测二级结构类型，并计算预测置信度［12］。预测囊膜蛋白615个氨基酸中α螺旋占40.98%，β折叠占12.68%，环结构占46.34%，属于混合型蛋白质，蛋白质残基表面暴露超过16%的氨基酸占50.08%，两个跨膜螺旋区383～400和550～570，与Gamier-Robson预测的α螺旋相符，胞内区第1～382，571～615两个区段，胞外区第401～549区段。PSIPRED服务网站采用双层反馈神经网络通过对PST-BLAST搜索得到同源序列预测蛋白质二级结构［12］。预测α螺旋占53.65%，β折叠占36.26%，无规则卷曲占10.08%。虽然各种方法预测的α螺旋，β折叠，β转角，无规则卷曲这些结构所占比例不完全相同，但都提示蛋白质OPAV-NM囊膜蛋白二级结构丰富，同时OPAV-NM囊膜蛋白具有多处转角及无规则卷曲区域，提示OPAV-NM囊膜蛋白具有较多的优势抗原表位区段。

图2 A Gamier＿Robson法预测OPAV-NM囊膜蛋白的二级结构Fig.2 A Secondary structure of envelope protein of OPAV-NM predicted by Gamier＿Robson method

图2 B SMOPA预测OPAV-NM囊膜蛋白的二级结构Fig.2 B Secondary structure of envelope protein of OPAV-NM predicted by SMOPA method

2.3 OPAV-NM囊膜蛋白的亲水性（Hydrophilicity）分析

用Kyte-Doolittle方法对OPAV-NM囊膜蛋白的亲水性进行分析。结果显示该蛋白有两个主要的疏水性区域，其位置是380～410和545～573，而且疏水性指数比较高，其中以囊膜蛋白的羧基端疏水性最高，提示可能为OPAV-NM囊膜蛋白的跨膜区。与Predictprotein预测的跨膜螺旋区相符（图3）。

图3 OPAV-NM囊膜蛋白的亲水性分析Fig.3 Hydrophilicity for the envelope protein of OPAV-NM

2.4 OPAV-NM囊膜蛋白的表面可能性（Surface probability）分析

OPAV-NM囊膜蛋白的氨基酸呈现在表面可能性较大的区域主要是第167～180、第474～495、第640～615区段，其他部位展示的可能性较小或表现为负值（图4）。

图4 OPAV-NM囊膜蛋白的表面可能性分析Fig.4 Surface probability for the envelope protein of OPAV-NM

2.5 OPAV-NM囊膜蛋白的柔韧性（Flexible）分析

OPAV-NM囊膜蛋白骨架区含有较多的柔韧性区域，且分布比较均匀，氨基端的柔韧性区域比羧基端相对分布多。提示该蛋白肽段的柔韧性较大，发生扭曲、折叠的几率较高，能形成丰富的二级结构（图5）。

图5 OPAV-NM囊膜蛋白骨架的柔韧性分析Fig.5 Flexible regions for the envelope protein of OPAV-NM

2.6 OPAV-NM囊膜蛋白B细胞抗原表位的预测分析

Bcepred是利用蛋白质的理化性质预测B细胞抗原表位，IEDB是利用氨基酸残基的理化性质和在实验中已证明抗原发生频率，研制开发的预测蛋白质B细胞抗原表位的半经验法，ABCpred是利用人工神经网络法预测蛋白质B细胞抗原表位［13-16］。综合DNA Star软件的Protean模块评价OPAVNM囊膜蛋白B细胞抗原表位，联合以上蛋白质二级结构，亲水性，表面可能性和柔韧性的预测，分析OPAV-NM囊膜蛋白潜在优势的蛋白抗原决表位，结果显示囊膜蛋白含有许多抗原指数好抗原性较高的区域，综合分析结果为第52～76，101～110，118～165，182～196，201～215，281～305，309～332，335～356，461～476，530～574位，共10个区段为OPAV-NM囊膜蛋白潜在的优势抗原表位（图6）。Predictprotein分析显示第401～549区段位于胞外区，而预测的优势抗原表位第461～476位氨基酸序列和第530～574位的部分氨基酸序列正位于胞外区，en-OPAV和ex-OPAV的囊膜氨基酸序列比对发现第530～574区段位于的差异区，该段氨基酸序列对绵羊肺腺瘤病毒疫苗和诊断方法的研究有重要意义。

图6 OPAV-NM囊膜蛋白的抗原指数分析与抗原性分析Fig.6 Antigenic index analysis and antigenicity analysis of the envelope protein of OPAV-NM

3 讨论

有研究表明，组成蛋白的氨基酸种类与该蛋白形成α螺旋结构的能力有关，例如，肽链中脯氨酸（Pro）或甘氨酸（Gly）的出现频率较高，将不利于α螺旋结构的形成［17］。OPAV-NM囊膜蛋白中Pro出现的频率是5.8%，Gly出现的频率是3.6%，相对较低，根据上述二级结构结果分析OPAV-NM囊膜蛋白中α螺旋结构所占比例在各种预测方法中最高，但是该蛋白也具有较多的β折叠，转角和无规则卷曲结构区段，因此该蛋白的二级结构丰富。蛋白质的转角及无规则卷曲是比较松散的结构，易于发生扭曲，盘旋并展示在蛋白的表面，因此该区域通常存在B细胞的优势抗原表位［18］。

当前疫苗学研制新型疫苗的一个研究热点是利用基因工程技术，其基本技术思路是通过分析病毒的基因组序列来预测病毒的所有抗原信息，然后筛选出合适的候选抗原，进而研制出有效的疫苗，这种研制 疫 苗 的 方 法 策 略 称 为 “反 向 疫 苗 学”［19］。OPAV-NM囊膜蛋白分析结果表明，在该蛋白近氨基端的转角和无规则卷曲结构区域相对较多，并且这些区域的抗原指数和亲水性指数较高，呈现在蛋白表面的几率也比较大，因此该区段的抗原表位应该是OPAV-NM囊膜蛋白优势抗原表位所在。研究表明OPAV囊膜蛋白可被OPAV-SU单抗识别，其中SU是OPAV囊膜蛋白的表面蛋白位于囊膜蛋白氨基端部分，与本文的预测结果相符［14］。尤其是第530～574位区域位于en-OPAV和ex-OPAV的囊膜氨基酸序列比对的差异区，且有部分氨基酸序列位于Predictprotein分析的胞外区（第401～549位），该段氨基酸序列对绵羊肺腺瘤病毒疫苗学和诊断方法的研究有重要意义。本次试验结果可作为ex-OPAV囊膜蛋白潜在的B细胞线性表位参考数据，在今后的ex-OPAV囊膜蛋白表位研究中，应采用软件预测结果与试验鉴定表位结合的方法对ex-OPAV囊膜蛋白的抗原表位加以鉴定，为今后OPAV反向疫苗学研究、多表位疫苗的研制、诊断试剂的制备及单克隆抗体的筛选提供科学的依据。

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