不同生境下苹果树腐烂病菌有性态的发生及生物学特性研究

陈臻　徐秉良等

摘 要： 【目的】为了明确苹果树腐烂病菌有性态在不同生境条件下的发生情况及生物学特性，【方法】以甘肃省6市11县（区）不同生境条件下患病的苹果树病皮为试验材料，对苹果树腐烂病菌有性态的形态学、形成时间、侵染性和子囊孢子萌发条件进行研究。【结果】甘肃省苹果树腐烂病原菌有性态为Valsa ceratosperma （Tode et Fr） Maire，仅分布在甘肃东部气候较湿润的天水、平凉、庆阳3地，形成时间天水在8月中下旬，平凉和庆阳在9月中下旬。平凉菌株子囊壳埋藏最深，达809.85 μm，与天水、庆阳菌株差异显著。三地的有性态子囊孢子在最适条件下均可萌发，36 h内不同光照条件下，各地子囊孢子的萌发率差异不显著。子囊孢子在不同光照和不同营养条件下都能萌发，以全黑暗条件下和PDA培养基上的萌发率最高。【结论】苹果树腐烂病菌有性态分布在气候较为湿润、年平均温度较高的地区，有性态无侵染性，光照和营养条件对子囊孢子萌发有显著影响。

关键词： 苹果树腐烂病； 有性态； 生境； 发生； 生物学特性

中图分类号：S661.1 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2013？雪04-0644-06

苹果树腐烂病是世界上危害苹果最为严重的病害之一，该病可造成树势衰弱、苹果品质和产量下降，严重时甚至可造成毁园[1]。甘肃省是全国苹果生产的优势产区和第2大省，截止2011年底，全省苹果挂果面积30.7万hm2，产量220万t，产值约60亿元[2]。但近年来，苹果树腐烂病发生日趋严重，已成为制约全省苹果产业健康持续发展的重要因素。据甘肃省植保植检站调查，2011年全省发病面积达7.5万hm2， 平均发病株率达40%左右，白银、天水、平凉、庆阳、陇南等地老果园发病严重，树势衰弱的果园可达60%左右。如何更好地防治该病，环境条件和致病菌的研究是关键。关于苹果树腐烂病原菌的研究国内外已有很多报道，但主要针对其无性态[3-5]，而有性态由于在田间比较少见，相关研究报道较少。最早关于有性态报道的是在1909年，日本学者宫部和山田[6]将苹果树腐烂病菌定为Valsa mali Miyabe et Yamada，Nakata[7]1941年研究发现中国北部苹果树腐烂病菌为 V. mali，Kobayashi[8]根据病原菌形态，主张将苹果树腐烂病菌学名V. mali改为V. ceratosperma （Tode et Fr） Maire，Hayova等[9]曾提及Valsa malicola Z. Urb在中国可能有分布，王旭丽等[10]研究证实黑龙江和陕西苹果树腐烂病菌有性态分别为Valsa ceratosperma （Tode et Fr） Maire和V. malicola Z. Urb。对不同生境条件下苹果树腐烂病发生情况，谢红江等[11] 分析了苹果腐烂病发生程度与树龄、品种、立地条件、季节及气候因子的关系。目前，国内关于苹果树腐烂病菌有性态在不同生境条件下的发生及生物学特性方面研究尚未见系统报道。为此，本研究选取了甘肃省有代表性生态区域的苹果生产区，对不同立地条件下苹果树腐烂病菌有性态的地域分布、发生、侵染性及生物学特性进行研究，旨在为探索病害流行规律及下一步防治工作奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 有性态形态学观察 取患病苹果树病皮，徒手切片，观察子座、子囊壳、子囊、子囊孢子的形态。测量不同地区有性态子囊壳的宽度、瓶颈的长度和埋藏深度。

1.2.2 有性态与无性态比例 取14个地区的患病苹果树病皮，每个地区采集的病皮中随机抽取50个样点，每个样点1 cm2，进行徒手切片，每个样点20片。统计各个地区有性态和无性态的片数，得出有性态与无性态片数的比例。

1.2.3 子囊孢子悬浮液的制备 参照方中达[12]制备孢子悬浮液方法，取患病苹果树病皮，剔除周围的组织，放在载玻片上，用刀片剖开，放在离心管中加无菌水，离心，弃去底部沉淀，即得到孢子悬浮液，并用无菌水稀释至每视野（10×40）20～30个孢子，用血球计数板统计孢子浓度。

1.2.4 分生孢子纯培养的制备 使用琼胶平板稀释纯化法[12]，用无菌水将树皮上溢出的分生孢子角洗下，稀释到每视野有5个左右的孢子，将稀释后的孢子悬浮液涂在PDA平板上，等长出单一菌落后，用打孔器打取单一菌落转接到新PDA平板上，在PDA上得到纯培养。

1.2.5 有性态的侵染性研究 选取1～2年生健康的苹果树枝条，截成15 cm的小段，用自来水冲洗干净，枝条顶端石蜡封顶，接种时用脱脂棉蘸取75%的酒精擦洗灭菌，然后用灭菌水冲洗3次、风干，用直径 5 mm铁钉钉帽烫伤枝条表皮，分别用纯培养的菌饼（5 mm）和子囊孢子悬浮液接在枝条的烫伤部位，以PDA空白菌饼作对照，每个处理20个重复，置于瓷盘中25 ℃保湿培养，第7天观察发病情况，计算发病率。

1.2.6 不同地区子囊孢子萌发力测定 同1.2.3的方法配制子囊孢子悬浮液，参照刘振宇等[13]方法进行子囊孢子萌发力测定。在较薄的PDA平板上用直径9 mm的灭菌打孔器打取小圆块，置于灭菌的载玻片上，孢子悬浮液均匀涂在PDA 小块上，19 ℃黑暗条件下保湿培养。每个处理重复6次，以五点取样法定时镜检，每个PDA 小块镜检100 个孢子左右。每隔12 h统计孢子萌发数及孢子总数， 计算孢子萌发率。

1.2.7 光照条件对不同地区子囊孢子萌发的影响 设置全光照、全黑暗、12 h光照与12 h黑暗交替 3个处理[13]，将孢子悬浮液涂于PDA 小块上，试验方法同1.2.6，每隔12 h统计孢子萌发数及孢子总数，计算孢子萌发率。

1.2.8 营养条件对不同地区子囊孢子萌发的影响 将子囊孢子悬浮液分别涂于PDA 小块和10% ABA 小块上[14]，试验方法同1.2.6。每隔12 h统计孢子萌发数及孢子总数， 计算孢子萌发率。

2 结果与分析

2.1 有性态病皮和病原形态特征

2.2 有性态形成的地区及与无性态的形成比例

2.2.1 有性态的分布 14个采集地中，天水市果树研究所，天水市麦积区南山万亩果园基地、甘谷县五里铺村，庆阳市镇原县杨宁村、宁县铁王村，平凉市庄浪县高川村、静宁县吴庙村7个采集地均有有性态存在。表明甘肃省苹果树腐烂病菌的有性态主要分布在东部的庆阳、平凉和天水3市。

2.3 有性态形成时间及侵染性

2.3.1 有性态形成时间 有性态在天水、平凉和庆阳三地均有分布，但形成时间不同，天水在8月中下旬、平凉和庆阳在9月中下旬。

2.4 不同地区产生的子囊孢子萌发条件研究

3 讨 论

关于苹果树腐烂病菌有性态的分布，本研究证实其分布多在气候较为湿润、年平均温度较高的甘肃东部地区，而干旱少雨、年平均温度较低的河西走廊未发现。关于有性态不同生境下的分布国内报道较少，仅有王旭丽等[10]报道在陕西富县和黑龙江伊春发现，病原为V. ceratosperma和V. malicola，这两个地区气候特征与甘肃东部地区较为类似。本研究病原形态特征鉴定结果显示，甘肃省苹果树腐烂病菌有性态的病原为V. ceratosperma，未发现V. malicola。目前，对苹果树腐烂病菌病原生物学特性研究仍以无性阶段分生孢子为主[16-19]，对有性阶段子囊孢子的研究较少，且主要集中在温、湿度和培养条件方面[20]，光照条件的研究未见报道，本试验中发现有性态地区的温、湿度等气候条件以及子囊孢子萌发的营养条件与Togashi[21]的研究一致，另外，通过光照条件对子囊孢子萌发的研究，明确了光照条件对子囊孢子萌发的影响。在有性态的侵染研究方面，Won[22]用烙伤接种法将V. mali接种健康树皮未见发病。本试验在进行病原菌侵染性研究时与以上一致，证实了有性态不具有侵染性，但是它在整个苹果树腐烂病菌侵染过程中的作用还不清楚，尚待进一步研究。本试验中三地区子囊壳的埋藏深度不同，这可能与当地气候、环境条件等有一定关系，但深层次的原因有待进一步探讨。

4 结 论

苹果树腐烂病菌有性态分布在甘肃东部地区，出现时间在8月中下旬至9月中下旬，进一步证实了有性态无侵染性，不同光照条件、营养条件对子囊孢子萌发有显著影响。（本文图版见插6）

参考文献 References：

[1] WANG Shu-tong， ZHANG Feng-qiao， CAO Ke-qiang. Bibliometric analysis of apple Valsa canker research in China[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences， 2010（25）： 13802-13804.

王树桐，张凤巧，曹克强. 我国苹果树腐烂病研究的文献计量学分析[J]. 安徽农业科学， 2010（25）： 13802-13804.

[2] Fruit Industry Management Office of Gansu Province. Fruit production of Gansu Province in 2011[J]. China Fruit News，2011， 28（10）： 11.

甘肃省果业管理办公室. 甘肃省2011年水果生产情况[J]. 中国果业信息， 2011， 28（10）： 11.

[3] ADAMS G C， WINGFIELD M J， COMMON R. Phylogenetic relationships and morphology of Cytospora species and related teleomorphs （Ascomycota， Diaporthales， Valsaceae） from Eucalyptus[J]. Studies in Mycology， 2005（52）： 1-142.

[4] FAN Min-zhou， ZHANG Wang-bin， AN De-rong. Identification on the pathogen of apple canker in Shaanxi[J]. Acta Agriculturae Boreali-Occidentalis Sinica， 2004， 13（3）： 60-61 .

樊民周，张王斌，安德荣. 陕西苹果树腐烂病病原菌的鉴定[J]. 西北农业学报，2004， 13（3）： 60-61.

[5] ZANG Rui， HUANG Li-li， KANG Zhen-sheng，WANG Xu-li. Biological characteristics and pathogenicity of different isolates of Cytospora spp. isolated from apple trees in Shaanxi province[J]. Acta Phytopathologica Sinica， 2007， 37（4）： 343-351.

臧睿，黄丽丽，康振生，王旭丽. 陕西苹果树腐烂病菌（Cytospora spp.）不同分离株的生物学特性与致病性研究[J]. 植物病理学报，2007， 37（4）： 343-351.

[6] CHEN Ce. Recent research for the apple tree canker， peach tree canker and other diseases abroad[J]. China Fruits， 1988（Suppl.）： 68 -76.

陈策. 国外对于苹果树腐烂病、桃树腐烂病以及其他同类病害的研究近况[J]. 中国果树，1988（增刊）： 68-76.

[7] NAKATA K. Disease of economic plants in northern China and Mongolia[J]. Kahoku Agr Exp Sta Rept， 1941（1）： 1-72.

[8] KOBAYASHI T. Taxonomic studies of Japanese Diaporthaceae with special reference to their life histories[J]. Bulletin Government Forest Research Experiment Station，Japan， 1970，226： 242.

[9] HAYOVA V P， MINTER D W. Valsa malicola[J]. IMI Descriptions of fungi and bacteria， 1998，1368： 1-3.

[10] WANG Xu-li， ZANG Rui， WANG Lei， KANG Zhen-sheng，HUANG Li-li. The occurrence of Valsa malicola on apple trees and its pathogenicity[J]. Scientia Silvae Sinicae， 2007， 43（9）： 23-26.

王旭丽，臧睿，王磊，康振生，黄丽丽. 苹果树Valsa malicola的发现及其致病性研究[J]. 林业科学，2007， 43（9）： 23-26.

[11] XIE Hong-jiang，CHEN Dong，YANG Wen-yuan， TU Mei-yan，LI Jing，SUN Shu-xia，JIANG Guo-liang. Investigation on the occurrence of Apple canker in different Habitats[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences， 2012， 40（1）： 133-135 .

谢红江，陈栋，杨文渊，涂美艳，李靖，孙淑霞，江国良.不同生境下苹果腐烂病发生现状调查研究[J]. 安徽农业科学， 2012，40（1）： 133-135 .

[12] FANG Zhong-da. Research methods of plant pathology[M]. Beijing： Agricultural Press， 1979.

方中达. 植病研究方法[M]. 北京： 农业出版社， 1979.

[13] LIU Zhen-yu， LI Shi-zhu， LU Yan-jun，MAO De-jiang，LIU Dong-guang. Study on the Pycindiospore germination of Valsa mali var. pyri[J]. Hebei Journal of Forestry and Orchard Research，1998，13（4）： 367-370.

刘振宇，李士竹，陆燕君，毛得奖，刘东光. 梨树腐烂病病原菌分生孢子萌发特性的研究[J]. 河北林果研究，1998， 13（4）： 367-370.

[14] QI Hui-xia， YANG Wen-lan， LI Shuang-min，LIU Zhen-shang. Affection on the apple rot disease pathogen growth under different culture conditions[J]. China Fruits， 2007（6）： 31-34.

齐慧霞，杨文兰，李双民，刘振赏. 不同培养条件对苹果树腐烂病病菌生长的影响[J]. 中国果树，2007（6）： 31-34.

[15] HAYOVA V P， MINTER D W. Valsa ceratosperma[J]. IMI Descriptions of fungi and bacteria， U.K， 1998，1366： 1-3.

[16] ZANG Rui， HUANG Li-li. Study on the pycindiospore germination of apple tree Valsa canker pathogen[J]. Acta Agriculturae Boreali-Occidentalis Sinica， 2007， 16（1）： 64-67.

臧睿，黄丽丽. 苹果树腐烂病菌分生孢子萌发及其影响条件研究[J]. 西北农业学报，2007， 16（1）： 64-67.

[17] CHEN Qu， ZHAI Hui-zhe， HU Tong-le， WANG Shu-tong，CAO Ke-qiang. Research on the condition of the conidiospore of apple tree canker[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences， 2011， 39（25）： 15337-15338， 15351.

陈曲，翟慧者，胡同乐，王树桐，曹克强. 苹果树腐烂病菌分生孢子产生条件研究[J]. 安徽农业科学，2011，39（25）： 15337-15338， 15351.

[18] ZHOU Zong-shan， XU Cheng-nan，WU Yu-xing， CHI Fu-mie，DING Yan-jie，QIAO Zhuang，CAO Ke-qiang. Study on acquisition method of apple tree Valsa canker pathogen conidiospore[J]. China Fruits， 2011（2）： 41-43.

周宗山，徐成楠，吴玉星，迟福梅，丁艳杰，乔壮，曹克强. 苹果树腐烂病病菌分生孢子获取方法研究[J]. 中国果树，2011（2）： 41-43.

[19] LIU Ru-xiang， WANG Shu-tong， SI Li-li，CHEN Qu，HU Tong-le，CAO Ke-qiang. Effect of environmental factor on the conidiospore germination and survival of apple tree canker pathogen[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences， 2011， 39（26）： 16009-16012.

刘如香，王树桐，司丽丽，陈曲，胡同乐，曹克强. 环境因素对苹果树腐烂病菌分生孢子萌发与存活的影响[J]. 安徽农业科学， 2011， 39（26）： 16009-16012.

[20] QIAO Guo-biao， MA Qiang， ZHUANG Xia. Study on artificial inoculation technology of fruit tree canker[J]. Inner Mongolia Science & Technology And Economy， 2007（13）： 89-90， 92.

乔国彪，马强，庄霞. 果树腐烂病人工接种技术研究[J]. 内蒙古科技与经济， 2007（13）： 89-90， 92.

[21] TOGASHI K. Some studies on a Japanese apple canker and its causal fungus， Valsa mali[J]. Journal of the College of Agriculture， Hokkaido Imperial University， Sapporo， Japan， 1925， 12（3）： 234-265.

[22] WON C N. Studies on the canker of apple trees[J]. Korean Jour of Protection， 1972（11）： 19-23.