树莓炭疽病病原菌鉴定

戴启东　李广旭等

摘 要： 【目的】为了明确引起树莓炭疽病的病原，【方法】从30份标样中采用组织分离法分离得到了18个代表性菌株，并随机选取一个菌株LN-14，对该菌株的形态学特征、菌落特性以及病菌的致病性进行了研究。采用真菌rDNA-ITS区域通用引物ITS1和ITS4对菌株进行PCR扩增，运用DNAMAN软件构建该菌株与其他近缘种类菌株的系统发育树。【结果】该菌在PDA培养基上菌落呈灰白色，产生黑色分生孢子盘，分生孢子无色、单孢子呈椭圆形12～19 μm×4～5 μm 。PCR扩增得到534 bp的特异性片段，测序、比对结果显示该菌与Colletotrichum gloeosporioides[HQ264183]、C. gloeosporioides[HQ264182]的相似性高达100%，与引起杧果炭疽病的C. gloeosporioides[JX560098]亲缘关系较近聚类为同一个分支，而与草莓炭疽病菌C. fragariae[JN943084]亲缘关系较远。【结论】形态学和分子鉴定表明辽宁地区树莓炭疽病的病原菌为胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）。

关键词： 树莓； 炭疽病； 病原鉴定； 胶孢炭疽菌

中图分类号：S663.2 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2013？雪04-0672-03

树莓（Rubus idaeus L.）为蔷薇科（Rosaceae）悬钩子属（Rubus L.）多年生落叶果树，小灌木。树莓属有700余种，主要分布于北半球温带、亚热带地区，在我国发现约200余种[1]。我国目前栽培的品种多由国外引入，随着树莓的大量种植，树莓病虫害的发生日趋严重。

树莓炭疽病是树莓上的一种十分重要的病害。笔者从2010—2012年间，分别在沈阳、丹东、营口、庄河等地的树莓基地进行了病害取样调查，发现在7—9月份该病害普遍发生，高温高湿天气发生尤为严重，该病主要危害叶片，在生长后期也可危害果实，严重影响树莓的产量和品质。到目前为止，引起该病害的病原菌种类尚未见文献报道。由于炭疽菌属真菌种类繁多、分布广泛，形态差别细微，该属某些种类在分类学上尚无定论，仅从形态学特征上很难对该属真菌进行种间的分类鉴定[2]。我们通过对病原菌的形态学分析结合rDNA-ITS序列分析的方法对引起树莓炭疽病的致病菌的进行鉴定，为该病害的进一步系统研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 树莓炭疽病病害标样的采集

2010年7月中旬至9月末，在辽宁果树所树莓苗圃以及沈阳东陵树莓基地采集树莓炭疽病发病叶片标样30余份，分离得到代表性菌株18份于4 ℃冰箱保存备用。

1.2 病原菌分离及形态学鉴定

对采集的病叶采用组织分离[3]法进行分离，先用自来水将感病叶片冲洗干净，然后用蒸馏水冲洗2～3次，在病健交界处切取边长2 mm的方形组织，放入70%酒精溶液中处理10～20 s，最后用无菌水冲洗3次，然后将病组织在无菌条件下转移至PDA平板培养基上25 ℃培养，4 d后挑取菌落边缘新鲜菌丝进行纯化，经3次纯化后将菌种保存在4 ℃冰箱备用。将保存的菌种25 ℃活化培养，待15～20 d产孢后挑取菌丝及孢子在显微镜下观察照相，参考文献[4-5]进行病原菌形态学鉴定。

1.3 树莓炭疽病菌致病性测定

致病性测定采用针刺法[3]接种。将保存的菌种转接到PDA平板上，25 ℃活化培养，15～20 d黑光灯照射培养待产孢后，用无菌水洗脱孢子配成浓度为2×105个·mL-1孢子悬浮液，用一次性无菌注射器吸取孢悬液直接穿刺接种分别接种到健康的树莓叶片上，并做保湿处理，无菌水作为对照，每处理接种8个叶片，3次重复。待发病后从病斑表面分离病原菌与田间采集的样品进行比较，并观察发病症状是否与田间自然发病症状相同。

1.4 rDNA-ITS区扩增与分析

2 结果与分析

2.1 病原菌形态学鉴定

2.2 致病性测定

2.3 树莓炭疽病菌rDNA-ITS序列分析

3 讨 论

随着分子生物学技术的不断发展和成熟，针对rDNA-ITS区段设计引物并进行PCR检测的方法被广泛应用于植物病原菌鉴定、检测以及病害诊断等方面[7]。由于植物rDNA-ITS区段在科、属水平上保守而在种间存在差异，针对这样的特性设计引物进行PCR检测已经成为国际上广泛使用的分子生物学方法[8]。本实验通过传统的形态学鉴定的方法结合rDNA-ITS序列分析的方法鉴定树莓炭疽病的致病菌种类，明确了该病原菌的分类地位，为该病害的进一步深入研究奠定了基础。

树莓炭疽病此前曾有文献报道是由炭疽菌属真菌引起的，但没有具体断定是炭疽菌属的哪个种，分类地位尚未明确[9]。本文通过对辽宁地区采集的树莓炭疽病菌株鉴定结果认为引起该病的致病菌为胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）。由于炭疽属真菌种类繁多，很多都是重要的植物病原菌，炭疽菌属的其他种类是否也能引起该病害并导致复合侵染到目前为止尚未见文献报道，需要今后进一步深入研究。

随着树莓的集约化种植，该病害在生长季节普遍发生并呈现上升趋势，尤其在一些感病品种上发生极为严重，引起早期落叶，严重影响树莓的品质、产量和植株寿命。树莓炭疽病的发生不同年份区别很大，冬季受冻害严重翌年生长季易于发病。防治该病害除了施用高效低毒杀菌剂外，加强田间管理也是行之有效的防治手段。注意及时清理田间病残枝和杂草，清除越冬菌源，合理灌溉和施肥，减少机械损伤，这些措施对病害的防控效果明显。（本文图版见插8）

参考文献 References：

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