血清中 MiRNA-26a检测在早期前列腺癌诊断中的意义

陶 然,韩 旭,罗振国

(佳木斯大学附属第一医院,黑龙江 佳木斯 154003)

前列腺癌(prostate cancer,PCa)在欧美国家尤其非洲裔黑人最常见;在亚洲及前苏联国家较少见。近年来,我国的经济增长迅速,前列腺癌的发病率增加。随着我国社会逐渐进入老年化,前列腺癌发病率必然加大。前列腺癌早期通常常没有症状,只有当肿瘤阻塞尿道,膀胱颈时,发生类似下尿道梗阻或刺激症状。因此,前列腺癌的早期诊断尤为重要。小分子 RNA(miRN A)的发现,为前列腺癌的研究带来希望。研究证实,人类的众多生理、病理过程都与 miRN A有关,包括前列腺癌的发生发展。本实验中,作者选取 miRN A家族的miRNA-26a,用 RT-PCR法检测前列腺癌患者(prostatic cancer,PCa)、良性前列腺增生 (benign prostatic hyperplasia,BPH)患者及正常人血清中 miRN A-26a的表达 ,研究其在前列腺癌诊断中的临床意义。

1 资料和方法

1.1 一般资料

收集佳木斯大学附属第一医院2011-03～2013-01门诊收治的良性前列腺增生患者血清20例,前列腺癌患者血清20例 ,正常人血清20例。

1.2 主要仪器和试剂

(1)主要荧光分析设备:ABI7000荧光定量 PCR仪。(2)试剂盒(miRN A提取试剂);miRN A TM PARISTM Kit ABI生物公司;(Applied Biosystem p/n AM 1556)试剂盒 ABI生物公司;TaqMan MiRN A Assays Kit ABI生物公司;Taq-Man MiRN A RT Kit200rxns ABI生物公司;TaqManTM Universal PCR Master Mix2ABI生物公司。

1.3 引物和探针

miRNA-26a反转录引物、PCR引物和探针分别来自ABI生物公司 TaqMan MiRN A RT Kit.和 TaqMan MiRNA Assay Kit

miR-26a for CTGTCAACGATACGCTACPCR GTAATCCAGGATAGGCT G U6 for RT GAACGCTTCACGAAT TTGcmiR-26a for GCTGTCAACGAT ACGCTACCT AACGGCATGACAGT GTCAG RT

1.4 PSA检测

由佳木斯大学附属第一医院检验科完成,查阅病历可获得。

1.5 miRN A的提取、分离和 RT-PCR检测

按照 ABI公司 miRNA提取试剂盒说明分离、提取 miRNA。严格按照试剂盒说明书方法步骤进行逆转录,最终获得血清 miRN A的反转录 cDN A产物。用上步反转录所得到的cDN A为模板,以 U6为内参,按照 TaqMan MicroRN A RT Kit.和 TaqMan MiRNA Assay试剂盒说明书对 miR-26a进行 PCR反应扩增。数据分析:采用校正曲线法进行分析。

1.6 统计学处理

采用 SPSS18.0软件对实验数据进行统计分析,数据采用均数士标准差 (± s)表示,采用单因素方差分析,P＜0.05为有统计学意义。采用 spearman双变量相关性分析,P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

1)miR-26a在前列腺癌,前列腺增生患者和正常人血清中的表达情况

以 U6作为内参检测 miRNA-26a的表达水平,检测系统为 ABI7000,通过系统检测 ct值表示目的基因 mRNA的表达量。其表达的相对变化以2一 vvCt表示。扩增曲线图。见图1。对 miR-26a表达情况进行分析,将它们分为前列腺癌血清组,增生血清组和正常人血清,采用单因素方差分析检验,P＜0.05有统计学意义。前列腺癌组患者血清中的 miRNA-26a水平明显增高,前列腺癌血清组 ,前列腺增生血清组的表达量分别为正常人血清组的10.26±7.56,1.50±1.70。

图1

2)前列腺癌患者 miR-26a表达与 Gleason分级评分和TPSA的相关性分析

前列腺癌患者血清中 miR-26a的表达与 Gleason存在着正相关,P ＜0.05,有统计学意义 ,相关系数为 0.682,用散点图表示,与 TPSA评分无相关性,P＞ 0.05,无统计学意义。

3 讨论

microRN A(miRNA)是 RN A分子中一类大小为 18～25个核糖核苷酸(nt)的非编码 RNA,它们通过与靶 mRN A互补配对结合的方式调节基因表达。近几年来 miRN A与肿瘤的关系得到了广泛关注,有研究报道显示,miRN A在多种肿瘤中表达发生改变,可能与肿瘤的发生发展有关,被认为起到癌基因或抑癌基因的作用,针对此特性竞争抑制或启动microRN A的功能为解决前列腺癌的诊断和治疗提供了可能性。

miR-26a是含有21个核苷酸(nt)的小分子 RN A,人类的大多数组织中都表达此类物质。经序列分析显示,人类的miR-26a常位于3号染色体的3P21.3,这个染色体的位点是不稳定的。本实验中,作者利用 QRT-PCR方法检测前列腺癌患者血清中 miRN A-26a的表达,良性前列腺增生患者及正常人为对照。结果显示 miR-26a在前列腺癌患者血清中呈高表达,并且与 Gleason存在着正相关,与 TPSA评分无相关性。在前列腺癌患者血液中出现这种 miRNA特异性的原因,这要有以下两种观点。1)miRNA作为癌基因或者抑癌基因的角色,直接参与前列腺癌的细胞凋亡。2)miRN A与雄激素信号的关系密切。前列腺癌的发生发展受雄激素影响,治疗进展期前列腺癌的重要方法就是去势治疗,miRNA具有雄激素应答功能,可与雄激素信号形成一个反馈回路,原理类似与人体的内分泌系统,但却复杂很多 ,例如:雄激素通过雄激素应答原件(ARE)调节 miR-26a的表达,后者直接加快 LNCaP细胞雄激素非依赖性生长;同时 miR-26a的靶基因是 BAK1,BBC3,p53,通过影响这些位点可以抑制细胞凋亡 ,促进肿瘤进展。结论,提示 miR-26a在前列腺癌诊断中相比于 PSA存在优势,可以早期预判肿瘤的恶性程度。