Ezrin与 MMP2在结肠癌组织中的表达及意义

程 开,吴雯婷,董慧慧

(佳木斯大学附属第一医院消化内科,黑龙江 佳木斯 154003)

结肠癌(carcinoma of colon)是结肠黏膜上皮和腺体发生的恶性肿瘤[1]。近年来大肠癌的发病率与死亡率有逐年上升的趋势[2]。肿瘤转移是结肠癌高死亡率的主要原因[3]。相关研究已证实,埃兹蛋白(Ezrin)与基质金属蛋白酶2(MMP2)在肿瘤细胞侵袭转移过程中,参与并促进了许多重要步骤,包括:细胞骨架结构的重构,细胞表面结构的抗原识别,改变细胞间黏附力,促进新血管形成,影响肿瘤细胞与免疫细胞间的作用。Ezrin蛋白与 MMP-2在促进结肠癌细胞浸润转移中的作用联合研究,国内外尚未见报道。本实验利用免疫组化法检测正常结肠组织及结肠癌组织中两蛋白含量,探讨两蛋白在结肠癌转移中的相关性。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

鼠抗人 Ezrin单克隆抗体,鼠抗人 MMP2单克隆抗体,免疫组化 SP检测试剂盒,DAB显色试剂盒,EDT A抗原修复液,PBS磷酸盐缓冲液(粉剂),粉剂型抗原修复液(柠檬酸法 ),多聚酶结合物 ,放大剂 (鼠 /兔 ),LEICA RM1020脱水机 ,ShanDoN Histocentre 3(包埋机 ),LEICA RM 2235切片机,LEICA HI1220烘片机,LEICA HI1210摊片机,电压力煲,照相显微镜。

1.2 方法

①留取自2011-01～ 2012-06佳木斯大学附属第一医院结肠癌手术标本 48例,对以上48例标本留取切端组织 (作为正常组织标本)。术后立即取材,每例留取标本大小约1.0cm×1.0cm×1.0cm。②取好的组织块放入脱水机,依次经过甲醛,由低到高梯度酒精脱水,二甲苯及石蜡固定包埋。③冰冻组织蜡块后经切片、展片、烤片制成片子。④切片经二甲苯,脱蜡,二甲苯,由高到低梯度酒精,蒸馏水冲洗,PBS液洗3次。⑤高温修复法修复组织抗原,PBS液洗片3次。⑥滴加一抗 50μL,4℃冰箱内过夜,PBS液洗片3次。⑦滴加放大剂50 μL,室温静置 10min,滴加多聚酶结合物 50 μL,室温静置1h,PBS液洗片3次。⑧滴加显色剂 DAB,苏木精复染2min,盐酸酒精分化,氨水返蓝 ,由低到高浓度梯度酒精,二甲苯,最后封片,镜检。

1.3 染色结果判定

Ezrin蛋白以胞浆呈棕黄色染色为阳性,MMP-2蛋白主要以胞膜呈棕黄色为阳性,可有少量胞浆棕黄色染色,且其着色强度高于背景非特异性染色者判定为阳性。以每张切片中阳性细胞占全部癌细胞的比例计算,每高倍镜随机选取5个视野计数,完全阴性或阳性率 ＜5%为阴性 (-);其余记为阳性(+)。

1.4 统计学处理

对数据进行整理 ,采用 SPSS Statistics17.0统计软件进行分析,本试验数据资料为定性资料,对组间差异选用卡方检验,相关性选用相关分析,设定 P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 Ezrin蛋白组免疫组化结果

结肠癌组织与正常结肠组织对比,Ezrin的表达有显著差异,有统计学意义 (P ＜0.01,i2= 45.511)。在结肠癌组织中 ,Ezrin的表达,与性别、年龄、分化程度无关,无统计学意义 (P值分别为0.412、0.650、0.782,均 ＞ 0.05);与有无淋巴结转移、不同 Duke’s病理分期有显著差异,有统计学意义(P值分别为 0.007、0.026,均 ＜ 0.05)。

2.2 MMP2蛋白组免疫组化结果

结肠癌组织与正常结肠组织对比,MMP2的表达有显著差异,有统计学意义 (P ＜0.01,i2= 43.344)。在结肠癌组织中,MMP2的表达 ,与性别、年龄、分化程度无关,无统计学意义 (P值分别为0.184、0.051、0.118,均 ＞ 0.05);与有无淋巴结转移、不同 Duke’s病理分期有显著差异,有统计学意义(P值分别为 0.017、0.039,均 ＜ 0.05)。

2.3 Ezrin蛋白与 MMP-2蛋白相关性分析

48例结肠癌组织中 Ezrin与 MMP2两者表达均阴性的有 5例,均阳性的有27例 ,Ezrin阳性同时 MMP2阴性的有 7例,Ezrin阴性同时 MMP2阳性的有 9例。Ezrin蛋白与 M MP-2蛋白无相关性 (P= 1.210,R= 0.159,P＞ 0.05)。

3 讨论

埃兹蛋白作为膜骨架连接蛋白,是这一庞大反应体系中,促进肿瘤细胞浸润转移的重要成员之一。在正常细胞中,Ezrin蛋白一面以 N端高度保守的 FERM域结构与细胞膜整合蛋白胞内面直接相连,或通过与膜周蛋白 EBP-50的PDZ结构域结合间接连接膜整合蛋白;另一面以 C端 actin结合位点与细胞骨架中丝状肌动蛋白[4]相连;而连接 N端与C端的中央区是α螺旋结构。正是由于埃兹蛋白这一特异分子空间结构,才赋予其重要的生理功能,即维持细胞正常形态,参与细胞内外物质转移及信号转导,参与细胞的生存及死亡。在 Ezrin的蛋白分子链上,存在多个功能位点,如:丝氨酸残基,酪氨酸残基,赖氨酸残基,苏氨酸残基[5];每种残基又有多个存在位点。这些残基都可通过复杂的机制被激活,使埃兹蛋白构象呈开放状态,促进各种细胞膜运动,影响膜整合蛋白粘附功能,通过影响多条信号转导通路间接参与肿瘤细胞的迁移。现发现的埃兹蛋白可直接或间接影响的细胞信号转导途径包括:Rho信号转导途径[6],赖氨酸受体信号转导途径,PKA信号转导途径,M APK信号转导途径[7],PI3K/AKT信号转导途径,APO1/Fas介导的细胞凋亡途径。

基质金属蛋白酶-2是 MMPs(基质金属蛋白酶家族)中重要成员之一。MMP-2属于明胶酶类的一种,主要酶解细胞外基质和基底膜中的Ⅳ型胶原和明胶。在正常情况下,MMP-2与基质金属蛋白酶抑制剂(TIM P)共同存在,并以一定比例始终保持着某种动态平衡,共同维持着细胞外基质新陈代谢的正常有序地进行,并保持着基底膜的完整性。当肿瘤微环境存在时,肿瘤细胞自身也合成并分泌基质金属蛋白酶,酶原形式的基质金属蛋白酶2,通过一些相关的信号转导通路的激活后 ,成为活化状态,活化的 MMP-2可与基底膜上受体结合,促进蛋白水解酶的激活及释放,这样细胞外基质中的 M MP-2相对于 TIM P-2过多,导致 ECM中明胶过度降解,BM的完整性破坏。肿瘤细胞这是就可利用细胞外基质及基底膜中的破损区域做定向运动,突破这道天然免疫防线基底膜,迁徙到肿瘤周围组织,还可进一步破坏血管的壁,利于肿瘤细胞和 MMP-2自身随血液循环到达远处形成转移灶。

从本实验研究结果看,Ezrin蛋白和 MMP-2在肿瘤细胞的浸润转移中都有促进作用,但 Ezrin与 MMP-2无相关性。二者在促进肿瘤细胞迁徙,扩散过程中,都通过多种方式,多种途径直接或间接促进、参与、影响肿瘤转移 ,其中都通过影响细胞膜上黏附分子起作用。埃兹蛋白在胞内对黏附分子作用,基质金属蛋白酶在胞外影响细胞黏附分子,从本实验结果两者无相关性推测,二者在影响黏附分子过程中,并不存在共同途径,而是通过各自不同的方式途径影响肿瘤细胞黏附性,促进肿瘤细胞浸润于转移的。二者各自影响肿瘤细胞黏附性的途径及机制尚不清楚,有待国内外相关学者的共同努力,深入研究。

图1 结肠癌组织中 Ezrin蛋白免疫组化染色(400倍)胞浆染色

图2 结肠癌组织中 M MP2蛋白免疫组织染色(400倍)胞膜染色

[1]李玉林,唐建武.病理学 [M].第6版.北京:人民卫生出版社,2003,217

[2]Greenlee R T.&.T Murray,et al.Cancer statistics[J].CA Cancer J Clin.2000,50(1):7-3

[3]Arabzadeh A.&.C Chan.&.AL Nouvion.&.V Breton.Hostrelated carcinoembryonic antigen cell adhesion molecule 1 promotes metastasis of colorectal cancer.[J].PMID:22469976

[4]Bretseher A.Regulation of cortical structure by the ezrin-radixinmoesin Protein family[J].Curr Opin Cell Biol,1999 Feb;11(1):109-16;PMID:10047517

[5]Polesello,C.and F.Payre.Small is beautiful:what flies tell us about ERM Protein function in development[J].Trends Cell Biol,2004,14(6):294-302;PM ID:15183186

[6]Van Buul J D,Hordijk P L.Signaling in leukocyte transendothelial migration[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2004,24(5):824-833

[7]L ozupone F,L uginiL,M atarrese P,et a l.Identification and relevance of the CD95-binding domain in the N-terminal region of ezrin[J].J Biol Chem,2004,279(10):9199- 207.PMID:14676203