GDNF在大鼠急性脊髓损伤中的表达及变化规律

周成福,南 鹏,马晓茹

(1.佳木斯大学附属第一医院骨外科,黑龙江 佳木斯 154003;2.佳木斯大学基础医学院,黑龙江 佳木斯 154007)

胶质细胞源性神经营养因子(glial cell linederived neurot rophic factor,GDNF)由 Lin等在1993年从大鼠神经胶质细胞系 B49的培养液中首先纯化并命名[1]。研究表明,GDNF是近年来发现的一种属于转化生长因子β且超家族成员的新型神经营养因子,最近己发现其对培养的 DA神经元、脊髓和周围运动神经元、交感觉神经元等多种神经元都具有促进生长及保护作用,是目前发现的活性最强的神经元营养因子[2]。GDNF在大部分脊髓组织中有广泛的分布,大多数脊髓组织中广泛存在的胶质细胞源性神经营养因子免疫组化检测,可发现在脊髓后角中 GDN F有免疫活性。GDN F在大鼠胚与胎时期广泛高表达于脑脊髓说明其对该类组织的发育与分化起营养作用,出生后在神经组织及其靶组织表达明显降低,成年大鼠则表达甚微。脊髓损伤后 GDNF的变化及规律没有提出明确研究。本实验采用免疫组化测定大鼠脊髓损伤后 0h、 2h、 12h、48h、72h脊髓组织 GDN F的含量 ,并与对照组进行比较分析,意在探讨 GDN F在脊髓损伤时的动态变化并为判断脊髓损伤提供临床依据。

1 材料与方法

1.1 实验对象

健康成年 Wistar大鼠56只(佳木斯大学动物中心饲养,大连医科大学购买),雌雄不限 ,体重200～300g。适应性饲养1周。动物室内自然光照单独饲养。室温保持24℃,噪音 (30±15)bd,全密闭式自然排风。饲以营养均衡饲料,保证饮水和食物,除实验因素外,不受其他任何不良影响。

1.2 大鼠脊髓损伤模型制作

损伤组采用改良 Allen[3]法制备大鼠脊髓损伤模型,以10%水合氯醛(0.3mL/100g)腹腔注射麻醉(戴手套以左手食指和拇指抓住大鼠颈后皮肤比较松弛的地,大小鱼际夹住大鼠尾部组织,使大鼠仰卧位选择左下或右下腹腔进针,回抽无血后注入),给予青霉素20单位左下肢肌肉注射后,俯卧位固定与操作台上,背部去除毛,常规术区碘伏消毒,铺无菌单,背部正中切口 (T10～ T12),钝性向下分离筋膜及椎旁肌肉,显露棘突后用咬骨钳去除棘突 ,打开椎板 ,暴露 T11、T12硬膜囊,用10g的重锤自10cm处沿瞄准器垂直打击放置在硬模上直径2mm的垫片上,造成外伤性脊髓损伤[4,5]见脊髓组织出现肿胀、出血 ,甚至断裂,大鼠出现摆尾反射,双下肢及躯体回缩扑动后自然松弛,双后肢迟缓性瘫痪,表明撞击成功急性脊髓损伤模型造模成功。术后清洁切口,以消毒温盐水冲洗损伤脊髓及创口后缝合肌肉,筋膜皮下组织及皮肤。清洗伤口周围血迹,防止大鼠感染等其他不可知因数,影响实验结果。等待大鼠麻醉苏醒后分别独自喂养,补充大量葡萄糖后,给予均衡饲料喂养,清洁温水,吹风机保暖 (大鼠在麻醉苏醒后和高位脊髓损伤可导致致低体温及低血压如处理不当大鼠死亡率较高),术后苏醒肌肉注射青霉素20单位日一次持续3d,每日温水清洗后肢及下腹部并擦干,2～3h1次,避免感染及坏死。每日按摩膀胱促进排尿2次 ,适时更换鼠笼中的木屑[4,5]。避免动物因感染、二便障碍导致其死亡,术后3d之内观察大鼠的状态如下肢活动功能进食排便,注意防止大鼠发生挤压死亡,严密观察大鼠切口,预防性擦拭碘伏。对照组采取同前方法咬开椎板后不损伤脊髓后给予缝合。

1.3 动物分组

动物随机分为7组,正常组和假手术组,其中6组制成急性脊髓损伤模型,1组作为对照组。

1.4 标本采集,制备和保存

分别于手术后 0h、2h、 12h、 24h、 48h、 72h自背部打开椎管,显露 T11、T12受伤脊髓,见脊髓组织肿胀出血坏死,变性如豆腐渣样,切取损伤节段和相邻头尾部节段长约7mm脊髓,置于三蒸水中清洗去除血迹,后给予4%多聚甲醛缓冲液里固定 ,存放于4℃冰箱过夜,脱水,石蜡包埋,制作成标本蜡块,冠状面连续切片,厚度5μm。

1.5 免疫组化

每组取8张切片分别行 GDNF检测,选择脊髓组织完整石蜡载玻片上依次滴加一抗、二抗、三抗然后滴加显色底物,DAB色素混合物。所用试剂和仪器为小鼠抗人 GDNF抗体、ABC试剂盒、DAB显色剂、DAB染色剂。免疫组化检测SABC法和 DAB染色。GT-120A全自动生物组织脱水机(上海市宇腾电子仪器有限公司);GT-100病理石蜡包埋机(上海市宇腾电子仪器有限公司);GT-98石蜡包埋冷冻机(上海市宇腾电子仪器有限公司);GT-2745A石蜡切片机;DT-90A摊烘烤片机(上海宇腾电子仪器有限公司);SIM bs-31恒温水浴箱;Metamoph Image System(UIC,美国 )DP10/Olympus BX 51(日本)显微摄影图像分析系统。

1.6 图像分析

光学显微镜100倍视野下可见正常组免疫组化切片可见脊髓后角组织中 GDNF阳性灰度值颜色浅阳性率低,假手术组可见脊髓后角灰度值及阳性率明显增多。应用 Metamoph Image System(UIC,美国 )/DP10/Olympus BX 51(日本 )显微摄影图像分析系统,400倍视野下,在损伤灶周围距损伤区200μ m范围内随机选取5个视野,对 GDNF免疫组织化学染色、原位杂交染色阳性反应物进行定量检测,测定阳性反应物平均灰度,然后应用 SPSS软件下进行统计学处理。

1.7 统计学处理

所有数据采集完采用 SPSS 18.0统计软件分析,所有实验数据均以均数±标准差 (± s)表示 ,进行方差检验 t分析,P＜0.05表示有显著差异。

2 结果

GDNF免疫组化染色结果:对照组及假手术组后0h组无特异阳性染色,假手术组 GDNF表达2h可见阳性率及灰度值明显变化且阳性率达到最高值,12h、24h、48h、有所改变GDNF的表达呈现下降趋势,72h几乎接近对照组。可见脊髓损伤后 GDNF的变化2h脊髓立即启动应急措施保护损伤脊髓进行自我修复。这一变化规律可以作为临床诊断脊髓损伤提供帮组和指导。见表1。

表1 各组大鼠不同时间点 GDN F的灰度值 (±s)

表1 各组大鼠不同时间点 GDN F的灰度值 (±s)

*具有显著性差异 (P＜0.05)。

组别时间 0h 2h 12h 24h 48h 72h对照组 2.30± 0.29 2.27± 0.16 2.33± 0.13 2.33± 0.23 2.28± 0.15实验组 2.33± 0.33 12.21± 0.65* 8.97± 0.59* 6.35± 0.34* 4.35± 0.34* 2.50± 0.15

3 讨论

脊髓损伤是世界性难题,每年给很多家庭带来灾难性的损失经常会导致四肢肌力下降,运动障碍,感觉过敏高位脊髓损伤甚至危及生命,而脊髓损伤的最佳治疗期在受伤的48h以内。早期的治疗不论是药物(单唾液酸四己糖神经节苷脂、激素)还是手术的前提必须是明确是否为脊髓损伤和损伤的时期如损伤早期大剂量激素冲击疗法和后续的单唾液酸四己糖神经节苷脂治疗,现代的诊疗方法,包括受伤机制、体格检查、影像学表现都是从各个方面来诊断脊髓损伤。带来的是复杂、繁琐、和不确定人为因素、价格的昂贵。我们试图需找一种简洁、迅速、快捷、低廉的诊断手法来解决我们我遇到的困难。如炎症反应时白细胞应急性升高,从这一思路而来我们也寻求一种可以有通过应急反应升高的特异性物质来诊断脊髓损伤。哺乳动物脊髓损伤(Spinalcordinjury,SCI)后感觉和运动仅有非常小的机会恢复,大部分不能恢复到损伤以前,因为神经细胞为不可再生细胞,肢体的感觉及运动有所恢复大部分了来源于胶质细胞,原因可能为中枢神经系统内不能提供的细胞生长的条件,致使绝大部分神经细胞的再生面临死亡,其中神经营养因子不足以及神经细胞的退变是不可缺少的的因素[6～8]。

哺乳动物从出生到成熟过程中,神经细胞再起过程起到了决定性的作用,而神经胶质细胞在维护其生长发育中充当了重要角色,他们广泛分布于神经周围,通过各种渠道,按一定的复制、转录、翻译,作用于特定的神经表面决定簇,发挥其特殊作用。随着分子生物学的发展,新的神经营养因子不断发现,同时对它们的基因序列、分子构成、分布特点、调控机制的研究也取得一定的研究成果。大量研究表明,脊髓损伤会引起神经化学物质的改变,诸如脊髓前动脉的改变、离子平衡的改变以及代谢改变,这些改变可以直接对神经元和胶质细胞产生神经毒性作用,神经修复重建是目前研究的重点之一。研究发现其与神经痛感觉过敏有关联,对损伤导致的细胞变性坏死有促进其再生作用[9]。研究显示,GDNF在脑缺血、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化等原因造成的神经损伤中具有明显的保护作用[10]。本研究通过制备动物急性脊髓损伤模型,采用免疫组织化学方法检测脊髓组织中不同时间点 GDN F的表达情况。正常组中可见到 GDN F在大脊髓前角后角中低水平表达;损伤后2h脊髓后角表达的GDNF达到高峰,12h后阳性率开始下降,24h、48h、持续下降,72h恢复到正常水平。GDN F通过目前我们已知和未知的方式。作用于特定相应的神经细胞群和细胞表面相应的决定簇,发挥神经营养作用。神经细胞和胶质细胞在各种营养因子和周围特定的微环境发挥着修复脊髓的作用。GDNF可能通过自分泌或旁分泌方式发挥作用,因为自分泌或旁分泌在损伤和应激状态下更具作用,为急性期脊髓损伤提供新的方法。

[1]Lin LF,Doherty DH,Lile JD,et al.GDN F:a g lia l cellline?derived neurotrophic factor for m idbr ain dopaminerg icneurons[J].Science,1993,260:1130-1132

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