骨髓增生异常综合征患者SALL4和Nanog的表达及其临床意义

丁柳美，黄红梅，高 松，邬扬炯，李 莹，化范例

(1.复旦大学附属金山医院检验科，上海 201508;2.复旦大学附属金山医院血液科，上海 201508)

骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome，MDS)是一组获得性造血干细胞克隆性疾病，以血细胞减少及病态造血为特点，但MDS异质性非常明显，大部分患者呈现慢性、良性的病程，而高危患者可转化为急性白血病，预后极差。促进MDS转化为急性白血病的机制未明，近年来研究表明，同源异型基因SALL4表达失衡可增加CD34+造血干细胞/祖细胞的增殖能力而促进白血病的发生[1]，另外一种干细胞转录因子Nanog则抑制p53表达并与正常细胞向肿瘤细胞转化有关[2-3]。MDS作为“白血病前期”，造血干细胞具有不断演变的特点，本研究对各亚型MDS患者外周血及骨髓有核细胞SALL4 mRNA和Nanog mRNA的表达情况进行了检测，以初步探讨MDS患者SALL4 mRNA和Nanog mRNA表达的临床意义。

材料和方法

一、标本来源

标本来源于复旦大学附属金山医院肿瘤血液中心2007年6月至2012年6月收治的75例MDS患者。所有患者均经细胞形态学、免疫学、遗传学或分子生物学确诊，按2008年第4版《WHO classification of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues》重新确认分型，其中难治性血细胞减少伴单系病态造血(RCUD)11例，难治性贫血伴环状铁粒幼红细胞(RAS)2例，难治性血细胞减少伴多系发育异常(RCMD)29例，难治性贫血伴原始细胞增多(包括RAEB-I和 RAEBII)28例，不能分类者(MDS-U)5例。男41例，女34例，年龄21～76岁。对照组30名，男18名，女12名，年龄31～59岁，为健康体检人群。

二、试剂和仪器

Trizol试剂为美国Invitrogen公司产品，红细胞裂解液购自无锡碧云天生物试剂公司，Prime-Script RT逆转录试剂盒及SYBR Premix Ex Taq荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)试剂盒均购自日本Takara公司，荧光定量PCR仪为德国Eppendorf公司产品(MasterCycler Realplex4 system)。引物由Invitrogen公司合成。

三、外周血和骨髓标本制备

外周血标本:抽取静脉血2 mL，置经乙二胺四乙酸(elhylene diamine tetraacetic acide，EDTA)处理的15 mL无酶离心管内;骨髓标本:抽取2～3 mL骨髓，立即置经EDTA处理的15 mL无酶离心管内。于30 min内进行以下操作:在离心管内加入3 mL红细胞裂解液，轻轻振荡混匀后静置10 min，室温470×g离心5 min，弃上清。重复裂解红细胞1次，加入1 mL Trizol试剂置－70℃保存以备提取总RNA。

四、总RNA抽提、逆转录PCR

采用 Trizol-氯仿-异丙醇方法提取标本总RNA，所提取的总RNA经紫外分光光度仪测定总RNA含量及260和280 nm处吸光度(A)值，260和280 mm A值在1.80以上者用于后续试验。每份标本取总 RNA 1 μg，按照产品操作说明，以20 μL体系逆转录为 cDNA。

荧光定量 PCR:登陆 GenBank查询 SALL4 cDNA序列，根据引物设计原则设计各目的基因扩增引物，SALL4上游引物 5'-CAGCACATCAACTCGGAGGAGGAGG-3'，下游引物 5'-ACTCAGAGATGCTGAAGAACTC-3'，扩增产物282 bp;Nanog上游引物5'-CAGCTGTGTGTACTCAATGATAGA-3'，下游引物5'-ACACCATTGCTATTCTTCGGCCAG-3'，扩增产物179 bp;内参GAPDH上游引物 5'-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3'，下游引物 5'-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3'，扩增产物127 bp。反应条件为95℃ 30 s预变性，95℃ 5 s，60℃ 30 s，共40个循环。反应体系为20 μL，每份标本均设3孔检测。

五、统计学方法

使用SPSS 16.0软件进行统计分析。mRNA表达变化以ΔΔCt作为统计量，符合正态分布和方差齐性的数据2组内比较采用独立样本t检验，多组内比较采用单因素方差分析，不符合正态分布和方差齐性的数据则进行秩和检验。分类资料比较采用χ2检验。SALL4 mRNA和Nanog mRNA表达(ΔΔCt)关系进行线性相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、MDS患者SALL4 mRNA和Nanog mRNA表达

30名正常对照外周血有核细胞均无SALL4表达，75例MDS患者中，39例外周血有不同强度的SALL4表达，有36例SALL4不表达。MDS患者SALL4表达明显高于正常对照(χ2=22.92，P＜0.01)。MDS患者骨髓标本的SALL4表达明显高于外周血标本(Z=5.60，P ＜0.01)，所有 MDS 患者骨髓中均可见SALL4表达。75例MDS患者及正常对照外周血均可见Nanog表达，但各亚型MDS患者表达明显高于正常对照(F=88.78，P＜0.01)。而且，MDS患者Nanog在骨髓中的表达水平与外周血基本相仿(t=0.898，P=0.371)，见图1。

图1 MDS患者SALL4 mRNA和Nanog mRNA的表达

二、MDS各亚型之间SALL4 mRNA和Nanog mRNA的表达

MDS各亚型之间在外周血和骨髓中的SALL4与Nanog表达均有明显差异，见图2。其中外周血有核细胞SALL4的表达几乎均局限于RAEB-Ⅰ和RAEB-Ⅱ2 个亚型，其余亚型少见表达(χ2=43.59，P＜0.01);骨髓中SALL4表达在各亚型之间同样差异明显(F=15.98，P ＜0.01);外周血和骨髓中Nanog的表达在不同MDS亚型患者之间均差异明显(外周血 F=27.47，P ＜ 0.01;骨髓 F=23.92，P ＜0.01)，以RAEB-Ⅰ和 RAEB-Ⅱ2 个亚型患者表达最强。另外，SALL4与Nanog在骨髓中的表达呈现一定的相关性(r=0.58，P ＜0.01)。

图2 SALL4 mRNA和Nanog mRNA在MDS各亚型之间的表达

三、SALL4 mRNA和 Nanog mRNA表达与MDS的转归

75例MDS患者中，共有7例患者转化为急性髓性白血病，其中5例为 RAEB-Ⅱ亚型，1例为RAEB-Ⅰ亚型，另外1例为RCMD亚型。虽然例数较少，但这些患者无论是外周血还是骨髓，其SALL4 mRNA和Nanog mRNA的表达均高于其他患者(SALL4 外周血 t=2.27，P ＜0.05;骨髓 t=2.85，P ＜0.05。Nanog 外周血 t=5.20，P ＜0.01;骨髓 t=5.51，P ＜0.01)。

讨 论

原癌基因SALL4是一类在进化过程中高度保守的基因。在正常骨髓CD34+造血干细胞/祖细胞中表达，而随原始细胞的分化成熟，其表达下调，对维持胚胎干细胞的多向潜能和自我更新有着重要作用[2]。SALL4作为调节生长发育的转录因子，可与其他造血调控因子共同作用于造血过程，影响白血病的发生和发展。本研究对SALL4与血液病中MDS的关系进行了初步研究，结果显示MDS患者SALL4表达明显高于正常对照，但有部分患者外周血始终未能诱导出SALL4表达，而患者骨髓中则均表达SALL4且明显高于外周血标本。由此可见，SALL4在外周血表达量较小，而骨髓由于含有较多的造血干细胞，对SALL4检测的敏感性明显增高。Lin等[3]最新的研究表明，MDS患者SALL4表达的升高可能源于基因的低甲基化。

2003 年，Chambers等[4]和 Mitsui等[5]几乎同时报道了一种在囊胚内细胞群、原始生殖细胞以及ESCs表达的新转录因子，将该基因命名为Nanog。Nanog除了有助于胚胎干细胞自我更新和维持其未分化状态，还可促进细胞增殖[6]。Nanog在癌细胞中的表达及其与p53之间的相互作用提示Nanog的表达与体细胞向癌细胞转化有关[7]。我们通过对Nanog在MDS中的变化以及其在疾病不同状态下的表达研究，发现虽然Nanog的表达方式与SALL4有所区别，但其表达亦明显高于正常对照，表明Nanog和SALL4在MDS的发生、发展中同样密切相关。SALL4与Nanog在骨髓中的表达量呈现一定的相关性，提示在MDS疾病的发展过程中，SALL4与Nanog具有同步变化的特点，二者可能共同参与了促进造血干细胞恶变的机制。

无论是在外周血和骨髓中，SALL4和Nanog的表达在MDS各亚型之间均存在明显差异:RAEB-I和RAEB-Ⅱ 2个亚型中Nanog和SALL4的表达明显高于其他亚型，这与 RAEB-I和RAEB-II亚型体内原始细胞数量明显升高相一致。王华等[8]运用逆转录PCR已经证实急性白血病患者高表达SALL4，其中以急性髓性白血病患者表达更为明显，而本研究相应地发现，在7例转化为急性髓性白血病的MDS患者中，其确诊MDS时的外周血及骨髓的SALL4和Nanog表达明显高于其他患者，提示MDS患者中Nanog和SALL4的表达可能从另外一个侧面反映白血病细胞的负荷，对疾病的转归具有一定的预测意义。SALL4和Nanog均与正常造血干细胞向白血病干细胞转化密切相关，二者是否具有协同作用有待于进一步研究。深入了解SALL4和Nanog的作用将有助于探讨MDS的发病机制及其各亚型之间在分子生物学水平上的差别，并为今后更准确地诊断和靶向治疗恶性血液病提供潜在的新途径。

[1]Yang J，Liao W，Ma Y.Role of SALL4 in hematopoiesis[J].Curr Opin Hematol，2012，19(4):287-291.

[2]Noh KH，Kim BW，Song KH，et al.Nanog signaling in cancer promotes stem-like phenotype and immune evasion[J].J Clin Invest，2012，122(11):4077-4093.

[3]Lin J，Qian J，Yao DM，et al.Aberrant hypomethylation of SALL4 gene in patients with myelodysplastic syndrome[J].Leuk Res，2013，37(1):71-75.

[4]Chambers I，Colby D，Robertson M，et al.Functional expression cloning of Nanog，a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells[J].Cell，2003，113(5):643-655.

[5]Mitsui K，Tokuzawa Y，Itoh H，et al.The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells[J].Cell，2003，113(5):631-642.

[6]Chambers I，Colby D，Robertson M，et al.Functional expression cloning of Nanog，a pluripotency sustainingfactor in embryonic stem cells[J].Cell，2003，113(5):643-655.

[7]Lin T，Chao C，Saito S，et al.p53 induces differentiation of mouse embryonic stem cells by suppressing Nanog expression[J].Nat Cell Biol，2005，7(2):165-171.

[8]王 华，谭 获，刘 芳，等.RT-PCR检测 SALIA4基因在白血病中的表达[J].临床血液学杂志，2008，21(6):600-602.