高效液相色谱法测定食品中乙二胺四乙酸二钠

魏冬旭 胡 珅 孙 莹 胡少新 韩广源*

(1.黑龙江出入境检验检疫局 黑龙江哈尔滨 150001；2.齐齐哈尔大学食品与生物工程学院；3.黑龙江省农业科学院玉米研究所)

1 前言

乙二胺四乙酸二钠对食品有护色、防腐、抗氧化和稳定的作用，可阻止或延缓食品褪色、氧化、酸败、浑浊及风味改变等，因此GB 2760-2011《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》中允许在软饮料、果酱、复合调味料、罐头、地瓜果脯等食品中使用乙二胺四乙酸二钠[1]。但是食入过多的乙二胺四乙酸二钠，会导致人体微量元素的流失，影响身体健康，还可引起呕吐、腹泻和急腹痛等症状。因此，各国政府对此都非常重视，制定了严格的限量要求，乙二胺四乙酸二钠在各类食品中残留限量在25mg/kg-365 mg/kg之间[2]。

目前，国内外关于食品中乙二胺四乙酸二钠的检测方法主要有高效液相色谱法[3-7]、薄层色谱法[8]、离子色谱法[9-10]和液相色谱-串联质谱法[11]；国内涉及的检测标准主要有2个[12-13]，但只适用于糖水板栗、苹果汁罐头和铁强化酱油。现有文献和检测标准未能完全覆盖表1中对食品检测所要求的品种，而且有些标准、文献采用CuCl2作为衍生化试剂，和乙二胺四乙酸二钠络合后并不稳定，如果样品中含有Fe3+，所进行的检测将不准确[14]；有些基质干扰大的样品检测低限不能满足限量25mg/kg要求。因此研究适合大多数食品品种，满足食品添加剂限量要求的乙二胺四乙酸二钠检测方法非常必要。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 仪器

液相色谱仪：Agilent 1200，配备紫外检测器（VWD）；电子天平：上海恒平科学仪器公司，MP5002；组织捣碎机：Morgec MBL 10；离心机：XiangYi L-550；均质器：IKA®T25；水相滤膜：0.45μm。

2.1.2 试剂

甲醇、三氯甲烷：色谱纯；磷酸二氢钾、三氯化铁、磷酸：分析纯；乙二胺四乙酸二钠标准品（CAS：6381-92-6）：购自Sigma-Aldrich公司，纯度≥99%；实验用水均为去离子水。

2.2 方法

2.2.1 样品前处理

2.2.1.1 样品提取

啤酒、果酒、果汁饮料、茶饮料：称取试样5 g(精确到0.01 g)于50 mL 玻璃具塞离心管中，加入40 mL水，待衍生化。

八宝粥、番茄酱、蓝莓果酱、鱼罐头、沙拉酱、金针磨罐头、板栗罐头：经组织捣碎机均质制备后，称取试样5 g (精确到0.01 g)于50 mL旋盖聚丙烯离心管中，加入15 m L水、20 m L三氯甲烷，10000 r/min均质2 min，4500 r/min 离心5 min。将上清液转移至50 mL玻璃具塞离心管中，再用15 mL水重复提取2次，合并提取液于50 mL玻璃具塞离心管中，待衍生化和净化。

2.2.1.2 标准溶液配制

准确称取适量的乙二胺四乙酸二钠标准品，用水溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中，得浓度为10 mg/ mL的标准储备溶液，此溶液转移至储液瓶中4 ℃下储存一周。使用前根据需要将标准储备溶液配制成适当浓度的标准工作溶液。

2.2.1.3 衍生化

标准溶液的衍生化：准确吸取适当浓度的标准工作液于50 mL玻璃具塞离心管中，加入40 mL水和1.0 mL 0.02mol/L三氯化铁溶液，混合，超声20mim；冷却至室温后，转移至50mL容量瓶中，用水定容至刻度。

样品溶液的衍生化：向上述样品提取溶液中加入1.0 mL 0.02mol/L三氯化铁溶液，混合，超声20mim；冷却至室温后，转移至50mL容量瓶中，用水定容至刻度。

2.2.1.4 净化

准确移取5 mL上述衍生化样品溶液于25 mL玻璃具塞离心管中，加入5 mL三氯甲烷，在旋涡混合器上混合2 min，4000 r/min 离心5 min。取上清液过0.45 μm滤膜供液相色谱仪测定。

2.2.2 液相色谱分析条件

色谱柱：SAX柱，150 mm×4.6 mm（i.d.），粒度5.0 μm；流动相：A（甲醇）:B（0.075 mol/L 磷酸二氢钾溶液，p H=2.3）=10:90（V/V）；流速：1.0 mL/min；柱温：25℃；波长：260nm；进样量：20 μL。

3 结果与讨论

3.1 提取试剂的选择

由于乙二胺四乙酸二钠易溶于水，微溶于乙醇，不溶于乙醚，所以本方法选用水作为提取剂。

3.2 衍生化方法的选择

与ED TA螯合的金属离子稳定性排序为Mo6+>Bi3+> Fe3+> Cu2+> Zn2+> Fe2+> Mn2+> K+>Ca2+> Mg2+，溶液中存在多种金属离子时，EDTA螯合优先与稳定常数大的金属离子进行反应，虽然Mo6+和Bi3+稳定常数大，但在食品中含量极微量，所以本方法中选择FeCl3作为衍生化试剂。本方法分别对衍生化时间、衍生化温度、衍生试剂浓度3方面条件进行了优化。

3.2.1 衍生化时间

移取500μg/mL乙二胺四乙酸二钠标准溶液于50mL不同的离心管中，分别加入0.1mol/L FeCl3溶液和40mL水，混合后在80℃水浴中进行10min、20min、30min、45min、60min、90min反应时间试验和超声波试验；反应结束后冷却并用水定容至50mL进行测定，结果见图1。从图1可以看出，乙二胺四乙酸二钠衍生化的反应时间无明显差异。

图1 乙二胺四乙酸二钠衍生化反应时间试验

3.2.2 超声波和衍生温度试验

按3.2.1的条件，在25℃、45℃、60℃、70℃、80℃下反应10min后进行测定，测定结果见图2。从图2可以看出，乙二胺四乙酸二钠衍生化的反应温度间无明显差异。

图2 乙二胺四乙酸二钠衍生化的反应温度试验

3.2.3 衍生试剂浓度试验

按3.2.1的条件，在50mL不同的离心管中加入1mL浓度分别0.1mol/L、0.05mol/L、0.04mol/L、0.03mol/L、0.02mol/L 的FeCl3溶液，在超声波中反应10min后进行测定，测定结果见图3。从图3可以看出，乙二胺四乙酸二钠衍生化试剂的溶液浓度间无明显差异。

图3 乙二胺四乙酸二钠衍生化试剂的溶液浓度试验

综上所述，乙二胺四乙酸二钠衍生化条件：在25℃下，选择0.02mol/L FeCl3的溶液1mL，超声反应10min。

3.3 样品净化

对于基质比较复杂的样品，在样品提取过程中加入一定量的三氯甲烷，可以去除样品中色素、脂肪等干扰物质。由于乙二胺四乙酸二钠只溶于水，不溶于有机溶剂，用三氯甲烷可以起到初步的净化效果。在样品溶液衍生化后，再次加入三氯甲烷，在旋涡混合器上混合2 min，4 000 r/min 离心5 min。取上清液过0.45 μm滤膜供液相色谱仪测定，在液相色谱上已完全没有干扰物质存在，液相色谱所用的阴离子交换色谱柱在这里也起到了一定的分离作用。

3.4 色谱柱和流动相的选择

经文献查阅，分析乙二胺四乙酸二钠衍生物常用的色谱柱为C18液相色谱柱。本试验首先选择XDB-C18、XDB-C8、SB-C18、Extend-C18(150mm×4.6 mm i.d.，5 μm)作为液相色谱柱和甲醇-0.02mol/L四丁基氢氧化铵水溶液（p H 3.5）作为流动相进行了实验。结果表明：这4款色谱柱对乙二胺四乙酸二钠衍生物都能达到分离目的，但对干扰物质的分离效果不好，影响乙二胺四乙酸二钠衍生物的测定。通过对乙二胺四乙酸二钠衍生物结构分析研究，认为该化合物仍然以阴离子形式存在，所以选择一款Agilent SAX阴离子交换色谱柱(150mm×4.6 mm i.d.，5 μm)进行试验，同时选择甲醇-磷酸二氢钾溶液（10+90）作为流动相，其磷酸二氢钾溶液浓度分别为0.025mol/L、0.05mol/L、0.075mol/L、0.1mol/L，每一浓度用磷酸调节溶液的p H分别为2.3、2.5、3.0进行试验。

试验表明：0.0 75 mo l/L磷酸二氢钾溶液（pH=2.3）时，其乙二胺四乙酸二钠衍生物的保留时间比较适中，在7.7min左右出峰，且与干扰物能进行有效地分离，具体分析见图4。所以本实验方法选择甲醇-0.075mol/L磷酸二氢钾溶液（p H=2.3）（10+90，V/V）作为流动相。

图4 啤酒中乙谱胺四乙酸二钠色

3.5 线性范围、检出限与定量限

配制一系列不同浓度标准溶液，在方法确定的实验条件下进行分析，测定其峰面积，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明，乙二胺四乙酸二钠衍生物的浓度在1.0μg/m L-100.0μg/m L范围内时，线性关系良好，其回归方程和相关系数分别为Y=28.5027487X - 3.683和0.9997。在空白基质中添加标准品，以信噪比(S/N)≥3 计算方法的检出限(LOD)；以信噪比(S/N)≥10 计算方法的定量限(LOQ)，该方法的LOD和LOQ分别为10 mg/kg和25 mg/kg。

3.6 回收率与精密度

以啤酒、果酒、果汁饮料、茶饮料、八宝粥、番茄酱、蓝莓果酱、鱼罐头、沙拉酱、金针磨罐头、板栗罐头为样品，采用标准添加法对添加样品分别进行回收率和精密度实验，每个样品做3个添加水平，每个添加水平做6次平行，以啤酒、八宝粥和板栗罐头数据为例，结果见表1。其平均回收率和相对标准偏差为88.64% -96.25%和4.86%-12.59%，结果符合SN/T 0001-1995《出口商品中农药、兽药残留量及生物毒素检验方法标准编写的基本规定》对回收率和精密度的要求[14]。

表1 啤酒、八宝粥和板栗罐头中乙二胺四乙酸二钠的平均回收率和精密度（n=6）

4 结论

本文建立了适用于不同食品基质中乙二胺四乙酸二钠的前处理方法和高效液相色谱检测方法，完全能够满足我国对外贸易和进出口商品检验把关的限量要求，解决了不同食品基质中乙二胺四乙酸二钠的检测问题，为食品安全检测提供实际方法和技术支撑。

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