免疫磁珠法富集沙门氏菌的优化及应用

山 珊，牛瑞江，赖卫华，刘道峰，魏 华，熊勇华

(南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，南昌大学，江西南昌330047)

沙门氏菌是自然界普遍存在的一种食源性致病菌，在世界各地的食物中毒中，沙门氏菌引起的中毒病例数占第一位［1］，常引起人类急性腹泻、呕吐、腹部疼痛、高烧和败血症等疾病［2］。沙门氏菌危害较大，在2006年欧盟调查中大约有160049人被确认感染了沙门氏菌［3］。2008年4～8月，美国有286人感染，2人死亡［4］。2010年美国因沙门氏菌污染，召回了约5亿枚污染鸡蛋。2010年在日本4090个农场中抽取203个调查，结果有48个农场显示阳性，占调查的23.6%［5］。2012年美国食品和药品监管局(FDA)统计，美国每年大约有400人死于沙门氏菌感染。为了加快沙门氏菌的检测速度，人们采用免疫磁珠的方法对样品进行富集。王海明等利用英国Matrix公司的Pathetrix免疫磁分离系统进行动态富集，目标菌捕获效率的平均值达到60%，三种浓度的沙门氏菌添加到8种食品基质中，目标菌捕获效率的平均值是23%［6］。张东方等［7］将免疫磁捕获和实时荧光PCR技术结合起来，16h内检测鸡肉中的沙门氏菌，检测限为104CFU/mL。王晓闻等［8］免疫磁珠捕获和PCR技术结合起来，在7h内检测了牛乳中的沙门氏菌，检测灵敏度为9CFU/mL。然而，目前未见采用免疫磁珠法对多种代表性的沙门氏菌进行系统研究的文献报道。本文专注于免疫磁富集的研究，较为系统地优化了沙门氏菌抗体与磁珠的多种偶联条件和免疫磁珠捕获工艺，用所制备的免疫磁珠对鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、鸭沙门氏菌和肠炎沙门氏菌五种具有代表性的沙门氏菌进行富集，并在食品基质中得到应用。本方法特异性强，准确性高，使用方便，结合前端的选择性增菌和后端的免疫层析分析，可以建立起完整的沙门氏菌快速检测系统。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

猪霍乱沙门氏菌(ATCC 10708)、甲型副伤寒沙门氏菌(ATCC 9150)、(鸭沙门氏菌ATCC 9150)、肠炎沙门氏菌(ATCC 13076)、鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 13311)、单核细胞增生李斯特氏菌(CMCC 54001)、大肠埃希氏菌(O157∶H7 CMCC 44828)、金黄色葡萄球菌(CMCC 26003) 均为本实验室保存;沙门氏菌多克隆抗体 本实验室制备;溶菌肉汤(lysogeny broth，LB)培养基 北京奥博星生物技术有限责任公司;MES Alafa公司;EDC、NHSS PIERCE公司;SM3-P100磁珠、PM3-020磁珠 上海奥润微纳新材料科技有限公司。

BHC-1300ⅡA/B3生物安全柜 苏州安泰;ZHWY-2102C恒温培养振荡器 上海智诚;TGL-16台式离心机 湖南湘仪;日立H-7500型透射电镜HITACHI;NICOMP380/ZLS型纳米粒度分析仪 英国PSS粒度分析仪公司。

1.2 实验方法

1.2.1 兔抗沙门氏菌免疫磁珠的制备及优化 取少量磁珠到离心管中，磁分离后弃上清，乙醇清洗后用PBS溶液调磁珠到合适浓度，超声处理，采用透射电镜观察磁珠的形状、大小和表面形态等特征。用活泼酯法将PM3-020磁珠表面的羧基活化，加入一定量的纯化后的兔抗沙门氏菌抗体［9］，其中磁珠用量分别取 0.05、0.2、0.4、0.5、1.0mg，抗体添加量分别取 10、20、30、50、75、100μg。将沙门氏菌接种到 LB 培养基中过夜培养，用平板涂布计数法计数后，再经浓度梯度稀释将菌液浓度调整为105CFU/mL。不同条件的免疫磁珠与相同浓度的菌悬液均匀混合，用0.1%蛋白胨水定容至1mL。室温孵育45min，转速30r/min，磁力架分离3min，取上清，用磷酸盐缓冲液清洗两次，将分离出来捕获有沙门氏菌的免疫磁珠、上清液和洗脱液采取合适的梯度，进行菌落计数［10］，每个梯度三个平行，所有的平板培养温度为(37±1)℃，时间为18～24h。通过平板计数法计算菌液的浓度，计算其捕获效率，免疫磁珠的捕获效率公式如下:

捕获效率(%)=磁珠捕获菌落总数/(磁珠捕获菌落总数+上清液中菌落总数+洗涤液中菌落总数)×100

1.2.2 免疫磁珠捕获工艺的优化 分别对免疫磁珠捕获过程中的菌浓度、反应时间、磁分离时间、磁场强度以及不同粒径大小磁珠进行优化。所选的菌浓度为 106、105、104、103、102CFU/mL;免疫磁珠与菌液的反应时间为10、30、45、60min;磁分离时间设为1、3、5、7min;再磁分离时采用磁场强度分别为 0.4、0.8、1.5T的磁分离器进行比较;取180和1150nm粒径的免疫磁珠与105CFU/mL浓度的菌悬液均匀混合，比较捕获效率。

1.2.3 免疫磁珠在杂菌体系中捕获效率的比较 将鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、单核增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌分别接种到LB中培养，将杂菌浓度调整为大约106CFU/mL后，取1mL菌液与免疫磁珠混合。孵育、磁分离，取上清，清洗两次，采用固体培养基进行菌落计数。

1.2.4 不同菌属捕获效率比较 将鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、鸭沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌活化后分别接种到LB培养基中过夜培养，将菌液浓度调整为大约105CFU/mL后，取1mL菌液与免疫磁珠混合。孵育、磁分离，取上清，清洗两次，采用固体培养基进行菌落计数。

1.2.5 免疫磁珠在实际样品中富集 称取牛奶和鸡蛋样品25g或25mL，加入到225mL BPW中，接种一定浓度的沙门氏菌，(36±1)℃，时间为8～18h。取1mL菌液与免疫磁珠混合。孵育、磁分离后，取上清，清洗两次，采用固体培养基进行菌落计数。

2 结果与分析

2.1 透射电镜表征

从图1中透射电镜照片可以看出，奥润PM3-020磁珠外观成球性较好，球体表面均匀，无杂质粘连，放大倍数为35.0×1000。从图2可得，磁珠偶联抗体前平均粒径为194.3nm，粒径分布较窄，多分散指数(PDI)为0.104，分散性好;磁珠偶联抗体后所得免疫磁珠的平均粒径为215nm，多分散指数(PDI)为0.163;免疫磁珠BSA封闭后的平均粒径为256.1nm，多分散指数(PDI)为0.189。

图1 羧基磁珠透射电镜照片Fig.1 TEM of carboxylated magnetic nanobeads

图2 磁珠粒径变化图Fig.2 Changes of magnetic beads size distribution

2.2 偶联抗体不同添加量结果和免疫磁珠工作浓度的确定

从图3可以看出，在制备免疫磁珠时，当抗体的浓度小于50μg/mg时，羧基化磁珠对抗体的吸附量随着抗体质量浓度的增加而增加。当抗体的质量浓度大于50μg/mg，羧基化磁珠对抗体的吸附量反而会下降。实验可得出抗沙门氏菌抗体中的饱和吸附量是50μg/mg。当免疫磁珠的量增加到0.4mg时，捕获效率基本保持稳定。磁珠是通过抗原抗体特异性结合来捕获菌，当菌的表面结合了足够量的磁珠时，再加入磁珠，菌的捕获量几乎不会有太明显的提高，所以选择0.4mg为最佳添加量。

图3 偶联抗体不同量以及免疫磁珠不同添加量捕获效率比较Fig.3 Comparison of the capture efficiency of different amount of antibody with the same bead and different magnetic immunobeads concentration

2.3 免疫磁珠捕获不同菌浓度结果和免疫磁珠与菌液最佳反应时间结果

从图4中可看到，比较不同菌浓度在纯培养体系中的捕获效率，菌液浓度为102～106CFU/mL，捕获效率为65%～82%，说明捕获效率比较稳定。磁珠的添加量是固定不变的，随着菌液浓度的增加而捕获效率降低的趋势比较小，这说明磁珠的浓度已经达到饱和状态。

在比较孵育时间图中可看到，从左至右的捕获效率分别为32.7%、45.9%、72%、73.2%。磁珠与菌液共孵育的时间越长，捕获效果越好，但是当孵育时间大于45min，效果就不明显了。结果说明孵育45min为最佳孵育时间。

图4 不同菌浓度捕获效率比较以及不同孵育时间捕获效率比较Fig.4 Comparison of the capture efficiency of different concentration of Salmonella with the same bead concentration and the capture dynamics charts of different immuno-reaction time

2.4 磁分离最佳时间、磁场强度和磁珠直径的确定结果

从图5可看到，在免疫磁分离图表中从左至右捕获效率分别为60.3%、83.2%、81.5%、78.3%。捕获效率随着时间延长到3min时达到最高，时间再延长捕获效率反而降低，说明3min为最佳磁分离时间。

在不同磁场强度的比较图中，磁场强度分别为0.4、0.8、1.5T，当磁分离时间是 3min时，磁场强度对捕获效率影响不明显，免疫磁珠添加量为0.4mg，孵育时间45min，捕获效率分别为57.39%、60.76%和63.74%。从安全考虑选择0.8T的磁分离器。

分别选用 PM3-020(180nm)和 SM3-P100(1150nm)粒径的免疫磁珠在纯培养体系中捕获目的菌，从不同磁珠直径比较的图中可看出，两种不同粒径的磁珠捕获时磁珠添加量为0.4mg、孵育时间为45min、磁分离时间为3min，捕获效率分别为65.8%和31.2%，结果说明在纯培养体系中纳米磁珠优于微米磁珠。

图5 不同磁分离时间、磁场强度和磁珠直径捕获效率比较Fig.5 Comparison of the capture efficiency of different immunomagnetic separation time and different food matrix and different size beads with the same bead concentration

2.5 特异性实验结果

由图6可见，目的菌中分别添加106CFU/mL的大肠杆菌O157∶H7、106CFU/mL的单核增生李斯特CMCC 54007和106CFU/mL的金黄色葡萄球菌CMCC26003，目的菌捕获效率分别为51.9%、56.4%、60.1%，杂菌捕获效率为5.6%、1.77%、1.06%，杂菌的捕获效率低，结果说明免疫磁珠的特异性好，杂菌的干扰少。

图6 特异性实验Fig.6 Specificity Test

2.6 对不同菌属捕获效率结果和食品基质结果分析

将免疫磁珠分别捕获鼠伤寒沙门氏菌(SalmonellaTyphimurium，S.T)、猪霍乱沙门氏菌(SalmonellaCholeraesuis，S.C)、甲型副伤寒沙门氏菌(SalmonellaParathpyiA，S.P)、鸭 沙 门 氏 菌(SalmonellaAnatum，S.A)和肠炎沙门氏菌(SalmonellaEnteritidis，S.E)，捕 获 效 率 分 别 为61.4% 、45.8% 、48.2% 、78.5% 、64.1% 。

由图7可知，纯培养、蛋清、蛋黄和牛奶基质的捕获效率分别为68.3%、44.3%、43.2%、65.2%。在牛奶基质中捕获效率65.2%接近纯培养捕获效率68.3%，说明牛奶基质对捕获目的菌的干扰小;在蛋清和蛋黄基质中捕获效率为44.3%和43.2%，与纯培养捕获68.3%有一定差距，说明蛋清和蛋黄基质对捕获目的菌的干扰较大。

图7 不同菌株和不同食品基质捕获效率比较Fig.7 Comparison of the capture efficiency of different strain and different food matrix with the same bead concentration

3 结论与讨论

制备捕获效率高的免疫磁珠时，选择粒径均匀的磁珠是制备免疫磁珠的一个重要前提，影响磁珠性能的因素有粒径大小、颗粒分散性、表面修饰基团分布、磁响应性、沉降速度等［11］。为了更好地提高磁珠的生物相容性和生物特异性，实验中采用交联剂将特异性抗体氨基与表面修饰有羧基的纳米磁珠偶联，偶联过程中，EDC起到活化磁珠表面羧基的作用，反应形成活泼酯，由于生成的活泼酯在溶液中不稳定易水解，为此立即加入NHSS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)，生成稳定的NHSS酯，同时达到活化羧基的目的，活化好的磁珠与抗体的氨基共价反应生成免疫磁珠［12］。整个制备过程包括活化、偶联、封闭与保存四个过程，在偶联过程中有时出现磁珠絮集沉降现象，实验采取超声进行分散，起到了很好的效果，得到分散性好的免疫磁珠。

国外商品化的免疫磁珠大多数是微米级的，微米级的免疫磁珠由于磁性较强，在大体系动态富集过程中有一定的优势。本研究为小体系静态富集过程，实验结果表明，纳米级免疫磁珠(180nm)的捕获效率优于微米级免疫磁珠(1150nm)。沙门氏菌表面结合磁珠的容量取决于两个参数，一是沙门氏菌表面(直径为0.5μm，长度为2μm)具有的抗原表位数量，另一个则取决于磁珠的体积大小。由于空间位阻的原因，磁珠体积大，磁珠与细菌可结合的位点将减少;磁珠体积小，磁珠与细菌表面可结合的量增加。当磁珠直径为200nm左右时，细菌表面可结合的磁珠量最大可能是100个左右，因此可以连接较多的免疫磁珠，从而细菌可以有效地被捕获;而微米级磁珠，由于空间位阻的原因，细菌表面与磁珠的结合位点下降为只有几个，细菌不容易被免疫磁珠所捕获。

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