小鼠主动脉平滑肌细胞Robo4膜蛋白的提取＊

倪 伟，刘 涛△，王浩宇，刘小艳，刘丽华，陈桂秀，白亦光，李 健（.川北医学院第二临床医学院南充市中心医院心内科，四川南充 67000；.川北医学院组织工程与干细胞研究所，四川南充 67000；.泸州医学院，四川泸州 646000）

Roundabout（Robo）蛋白属于神经细胞黏附分子，是神经轴突导向分子家族Slit蛋白的单次跨膜受体［1］。Robo蛋白在神经系统已被确认具有重要的轴突导向功能，但是，它们在哺乳动物血管系统的作用并不是很明确［2］。研究证实，血管内皮细胞和平滑肌细胞上均有Robo4膜蛋白的表达［3］，Robo4可抑制内皮细胞迁移、病理性血管新生和内皮高渗透性，但Robo4在平滑肌细胞上的作用却知之甚少［4］。为此，本文通过体外培养小鼠主动脉平滑肌细胞（MASMCs），优化MASMCs膜蛋白提取方法，获取高纯度的Robo4膜蛋白，为后续实验研究Robo4膜蛋白在MASMCs上的作用提供重要的技术支持，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料来源

1.1.1 实验动物 ICR小鼠3～4只，雌雄不限，8周龄以上，购于川北医学院实验动物中心。

1.1.2 主要试剂 DMEM／F12培养基、胎牛血清、胰蛋白酶（HYCLONE公司），Ⅰ型胶原酶、二甲基亚砜（Sigma公司），青霉素、链霉素（索莱宝公司），兔抗α－SMA多克隆抗体（博奥森公司），羊抗Robo4多克隆抗体（Santa Cruz公司），羊抗GAPDH多克隆抗体（Genscript公司），山羊抗兔FITC标记IgG二抗（中衫金桥公司），HRP标记兔抗山羊IgG（H＋L）（RARTH公司），膜蛋白提取试剂盒、BCA蛋白含量检测试剂盒、预染彩色蛋白分子量Marker（凯基生物公司），脱脂奶粉（SCIENTIFIC RESEARCH SPECIAL公司 ），高敏发光ECL试剂盒（Millipore公司）。

1.1.3 主要仪器 CO2培养箱、台式高速冷冻离心机、－80℃冰箱（Thermo公司），微量移液器（Eppendorf公司），荧光倒置显微镜（Nikon公司），倒置生物显微镜（上海万衡精密仪器公司），T－25细胞培养瓶、离心管（Corning公司），垂直电泳槽、电泳仪、凝胶成像系统（BIO－RAD公司）。

1.2 方法

1.2.1 原代细胞培养 颈椎脱臼法处死ICR小鼠，将整个小鼠浸泡于75%乙醇中消毒约5min。在无菌状态下，逐层剪开胸腔，分离取出主动脉，放入含有无菌磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中。用眼科剪、眼科镊尽量去除血管外膜的脂肪和纤维组织，再用含抗菌药物的PBS清洗血管的外表面及血管腔内的血凝块3次，将主动脉放入另一无菌培养皿中，用眼科剪纵向剪开血管，再剪成小段，收集到15mL离心管中。用0.1%的胰蛋白酶和0.1%的Ⅰ型胶原酶消化组织块（置37℃水浴）约40～50min。然后进行镜检，终止消化时加入含10%胎牛血清的DMEM／F12培养液，200目不锈钢筛网过滤去除大的组织。1 200r／min离心5min，倒掉上清液，沉淀用培养基悬浮，接种25cm2培养瓶。最后放入37℃，5%CO2培养箱中培养。24h后，观察细胞是否贴壁，大量贴壁后，更换1次培养基，放入培养箱中继续培养，3～4d更换1次培养液，7～9d MVSMCs可铺满T－25细胞培养瓶，用0.125%胰蛋白酶消化后进行传代培养。

1.2.2 膜蛋白的提取 收集不少于1×107细胞，用冷PBS（pH＝7.4）洗涤细胞2次（每次3 000r／min，离心5min）；在细胞标本中加入1mL Lysis Buffer（使用前，每1毫升Lysis Buffer加入1μL蛋白酶抑制剂和1μL 1mmol／L DTT），置玻璃均浆器冰中均质30～50次，置于冰上冷却。均质或超声破碎细胞后镜检，细胞破碎率不小于90%；将均浆液转移至冷的离心管中，于4℃，3 000r／min离心10min，弃沉淀；取上清液转移至新冷离心管中，于4℃，14 000r／min离心30min，所得上清液转至新管中，即为胞浆蛋白，分装冷冻保存；取沉淀，加入1 mL冷的抽提Buffer，涡旋振荡混匀后，4℃放置10～15min；于4℃，3 000r／min离心5min，取上清液转移至新管，进行下步提取；置于37℃水浴10min；于室温，13 000r／min离心5min，标本分成上层和下层，最终得到的下层即为膜蛋白提取物。

1.2.3 BCA法测定总膜蛋白含量 按照BCA蛋白含量检测试剂盒制作标准曲线，稀释待测标本至合适浓度，使标本稀释液总体积为20μL，加入BCA工作液200μL，充分混匀，37℃放置30min后，在562nm波长下比色，记录吸光值。根据所测标本吸光值，在标准曲线上查得相应蛋白含量，除以稀释液总体积，乘以标本稀释倍数，即为标本试剂浓度（μg／μL）。

1.2.4 Western－Blot检测 根据 Robo4蛋白相对分子量约150×103，配制8%SDS－GAGE分离胶和5%SDS－PAGE浓缩胶进行灌胶，根据标本蛋白浓度调整上样体积，加入5×SDS上样至终浓度为1×，上样总体积不超过20μL，上样前将标本于沸水中煮5min使蛋白变性。上样后，开始电泳，预染Marker监测蛋白电泳情况，设置GAPDH内参。积层胶电压40V，20min，到达界面后提至120V，电泳90min，电泳结束后，进行蛋白质半干转，20V，20min。转膜结束后，用5%脱脂奶粉摇床封闭1h。封闭结束后，加入1∶100稀释的Robo4抗体，室温孵育1.5h。用含0.05%吐温20的磷酸盐溶液（PBST）洗膜4×10min。加入1∶5 000稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1h，PBST洗膜4次。按说明书进行增强的化学发光（ECL）显色。

2 结 果

2.1 膜蛋白的浓度 根据蛋白标准品及其对应吸光度A值，计算出标准曲线（图1），测得标本平均吸光度A值为0.259，由此推算出总膜蛋白浓度为1.47μg／μL。

图1 BCA法测定蛋白浓度标准曲线

2.2 Western－Blot检测目的蛋白条带 在MASMCs上检测到Robo4膜蛋白的表达，蛋白相对分子质量约150×103（图2）。

图2 膜蛋白Robo4及GAPDH在MASMCs上的表达

3 讨 论

细胞膜蛋白的提取原理是裂解细胞后，先离心分离出质膜粗提物，再利用特殊的抽提Buffer，选择性地分离提取膜蛋白，抽提Buffer含一种特殊的去污剂，在4℃时所有的蛋白质均可都溶于抽提Buffer，但在37℃时，抽提Buffer分为水相和去污相；此时亲水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污剂相中，根据该性质分离出膜蛋白。产物不仅含细胞膜蛋白，也含胞器质膜蛋白。该方法提取膜蛋白成功的关键还在于：（1）保证足量的蛋白来源，细胞不少于1×107个，组织标本200～300 mg，且尽量去除脂肪组织和结缔组织等非目的组织。（2）膜蛋白的提取需要在冰上进行，尽量减少蛋白流失，提取蛋白所需的玻璃器具、离心管需预冷，玻璃均浆器冰上均质30～50次，通过镜检，细胞破碎率要达到90%以上。（3）膜蛋白的分离提取需要在高速低温的条件下进行，离心机转速13 000r／min以上，且离心机需预冷至4℃。（4）进行膜蛋白的提取最好使用进口透明性较好的微量离心管，以利于下层膜蛋白有机相的观察，因为上下两层液体为透明，只在交界处有一折光线，需仔细观察才可见到，室温静置30min至1h亦可见分层。（5）若需提取更高纯度的膜蛋白，可在获得的下层膜蛋白有机相中加入500μL冰冷灭菌水，置于4℃5min，置于37℃10min；室温下13 000r／min，离心5min，标本分成上层和下层（含膜蛋白），重复该步骤2次，获得纯度更高的膜蛋白。（6）若目的膜蛋白本身表达丰度较低，BCA法测得总膜蛋白浓度小于1μg／μL，可在SDS－PAGE电泳前进行蛋白浓缩：每100微升膜蛋白提取物，加入约300μL溶解Buffer和100μL三氯乙酸（TCA）试剂，混匀置冰上20～30min后，13 000r／min离心15min，尽可能除去上清液；沉淀加入1mL丙酮，室温静置10min后，13 000r／min离心15min；弃上清液，沉淀真空旋干或置冰上干燥约10min（敞开离心管盖），加入适当体积的Loading Buffer，煮沸3～5min，上样进行电泳。

Robo属于神经细胞黏附分子，是Slit蛋白的单次跨膜受体，包括4种亚型（Robo1～4），Robo1、Robo2和Robo3胞外区域相同，包含5个免疫球蛋白（Ig）样结构域和3个Ⅲ型纤维连接蛋白重复序列，胞内尾区含有4个保守区基序，即CC0、CC1、CC2和CC3。但Robo4胞外区域只含2个免疫球蛋白样结构域和Ⅲ型纤维连接蛋白重复序列，胞内只含CC0、CC2基因序列，其蛋白相对分子质量约在150×103［5］。目前的研究认为，Robo4能够调控内皮细胞的迁移及血管新生，参与血管生长因子的信号转导，在血管稳定性的调节中发挥重要作用［2，6］。最近研究发现，Robo4也表达在血管平滑肌细胞，但Robo4在血管平滑肌细胞上的作用并未见相关报道［3］。因此，研究Robo4膜蛋白在MASMCs生理和病理状态下的表达及意义［7］，对于揭示动脉粥样硬化、冠状动脉血管再通术后再狭窄等心血管疾病的发病机制具有重要意义。作者希望通过建立一种稳定、便捷的膜蛋白提取方法，获得高纯度的Robo4膜蛋白，进而为研究Robo4膜蛋白在MASMCs生理和病理状态下的表达及意义奠定基础。该膜蛋白提取方法，所获得的总膜蛋白经BCA法测定浓度为1.47μg／μL，可直接用于SDS－PAGE电泳，经 Western－Blot法检测到目的蛋白Robo4的表达。

综上所述，该膜蛋白提取方法简单，可靠，快速，获得的膜蛋白纯度较高，可直接用于SDS－PAGE电泳及 Western－Blot等后续试验，为研究Robo4膜蛋白在MASMCs上的生物学功能提供了技术保障。

［1］Huminiecki L，Gorn M，Suchting S，et al.Magic roundabout is a new member of the roundabout receptor family that is endothelial speci？c and expressed at sites of active angiogenesis［J］.Genomics，2002，79（4）：547－552.

［2］Jones CA，London NR，Chen H，et al.Robo4stabilizes the vascular network by inhibiting pathologic angiogenesis and endothelial hyperpermeability［J］.Nat Med，2008，14（4）：448－453.

［3］Zhang B，Dietrich UM，Geng JG，et al.Repulsive axonguidance molecule Slit3is a novel angiogenic factor［J］.Blood，2009，114（19）：4300－4309.

［4］Park KW，Morrison CM，Sorensen LK，et al.Robo4is a vascular specific receptor that inhibits endothelial migration［J］.Dev Biof，2003，261（1）：251－267.

［5］Seth P，Lin Y，Hanai J，et al.Magic roundabout，a tumer endothelial marker：expression and signaling［J］.Biochem Biophys Res Commun，2005，332（2）：533－541.

［6］Jones CA，Nishiya N，London NR，et al.Slit2－Robo4signaling promotes vascular stability by blocking Arf6activity［J］.Nat Cell Biol，2009，11（11）：1325－1331.

［7］魏本，郭富强.Periostin与血管支架内再狭窄关系的研究进展［J］.川北医学院学报，2012，27（4）：313－317.