阿托伐他汀通过激活PI3K/Akt/mTOR信号转导而促进神经元突起生长

屈文慧，郁盛雪，隋海娟，金迎新，金向楠，金 英

(辽宁医学院1.药理学教研室，2.2008级临床医学专业本科，辽宁锦州 121001)

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)患者记忆力下降的主要原因被认为是海马和皮质神经突触的丢失和神经突起的功能障碍。磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide-3 kinase，PI3K)具有类脂激酶和蛋白激酶的双重活性，普遍存在于机体各类细胞中，可受多种细胞因子和理化因素激活，研究表明，PI3K/Akt信号转导通路在神经元突触极性的形成与稳定中起关键性作用[1]。有报道PI3K参与了神经细胞发育、分化、分级、生长、存活、细胞骨架重组、调节分泌和受体运输等多方面生理功能[2]。目前大量实验证明，PI3K阻断剂抑制树突早期发育和生长[3－7]。蛋白激酶 B(protein kinase B，PKB)，为逆转录病毒Akt-8的癌基因产物，故又称Akt，激活后能介导多种生物学效应，是控制细胞生长的主要调节因子[8]。有研究报道Akt/哺乳动物西罗莫司(sibrolimus，雷帕霉素)靶蛋白(mammalian target of Rapamycin，mTOR)信号转导通路主要调节树突分支的形状和程度，特别是调节树突树的发育[9]，及神经元胞体大小[10]。核糖体 S6激酶(ribosomal S6-kinase，p70S6K)和真核翻译起始因子4E结合蛋白1(eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1，4E-BP1)是mTOR下游两个重要的靶蛋白，它们分别启动蛋白质的翻译和促进蛋白质的合成，继而对细胞生长和代谢进行调控[11]。

阿托伐他汀(atorvastatin，Ato)属于他汀类药物，因其具有半衰期长、代谢好和强效安全的调脂作用而广泛用于临床。Ato为脑外药物，必须经过一系列的信号级联反应才能引起细胞内的相应改变。应用MEK阻断剂PD98059(50 μmol·L－1)阻断Ato对神经元突起生长的促进作用并不明显，从而推测Ato促进神经元突起发育作用可能与激动MEK/ERK信号转导通路有一定关系。前期研究发现，Ato对培养皮质神经元突起生长有促进作用，本实验探究Ato是否通过PI3K/Akt/mTOR信号转导通路影响神经元突起发育。

1 材料与方法

1.1 药品和试剂

Ato，批号23922105，纯度＞98%，购自 LKT Laboratories，Inc.公司，用二甲亚砜(DMSO)溶解。DMEM、F12、DMSO、胰蛋白(1∶250)和多聚赖氨酸，均购自Sigma公司;PD98059、LY294002和西罗莫司，购自碧云天生物技术研究所;新生胎牛血清、马血清和HEPES，购自北京华美转导科技有限公司;阿糖胞苷，购自意大利SPA公司;mTOR Substrates Antibody Sampler Kit和Phospho-Akt Pathway Antibody Sampler Kit，购自 Cell Signaling公司;曲西立滨、兔抗神经元特异性烯醇化酶(neuronspecific enolase，NSE)多克隆抗体、鼠抗神经丝蛋白(neurofilament，NF200)单克隆抗体和山羊抗兔和山羊抗鼠二抗，均购自Santa Cruz公司;β肌动蛋白抗体，购自Beyotime试剂公司;SuperSignal West Pico化学发光底物，购自美国Thermo Scientific公司。

1.2 皮质神经元培养

出生24 h以内的Sprague-Dawley大鼠乳鼠，动物合格证号:SCXK(辽)2003-0007，辽宁医学院动物实验中心提供。乳鼠75%乙醇浸泡消毒，无菌条件下取出大脑皮质，置于培养基中，剔除血管和软脑膜，剪成1 mm3左右的小块。加入0.125%胰蛋白酶37℃消化10 min。待细胞分散后，加入含10%胎牛血清和10%马血清的DMEM/F12培养基终止消化。200目筛网过滤，1000×g离心10 min，用含10%胎牛血清和 10%马血清的DMEM/F12培养基制成细胞悬液，调整细胞密度为1×108～1 ×109L－1，接种在铺有 L-多聚赖氨酸24孔或6孔培养板中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养。培养48 h后加入含阿糖胞苷(终浓度为5 mg·L－1)的培养基，抑制非神经细胞增殖。以后每2 d换液1次，培养6 d后用于实验。应用抗NSE多克隆抗体和NF200抗体免疫荧光染色进行神经元纯度鉴定，结果表明神经元纯度在90%以上。

1.3 实验分组及处理

细胞分为正常对照组，加入等量培养基;Ato组，培养4 d 神经元加入 Ato 10 μmol·L－1作用48 h;阻断剂+Ato组，培养4 d神经元分别加入MEK阻断剂 PD9805950 μmol·L－1、PI3K 阻断剂 LY29400230 μmol·L－1、Akt阻断剂曲西立滨 2.5 μmol·L－1和mTOR阻断剂西罗莫司100 nmol·L－1作用1 h，再加入 Ato 10 μmol·L－1共同作用 48 h。本实验各阻断剂的使用浓度根据有关文献[12]报道和预实验结果确定。

1.4 神经元树突形态学观察分析

应用倒置相差显微镜，将每个神经元拍摄到一个视野中。采用Tsview软件进行统计分析。计数样本来自3个不同批次培养的神经元，每批次随机选取40～50个细胞。

1.5 Western印迹法检测磷酸化磷酸肌醇依赖激酶1、磷酸化 Akt、磷酸化 mTOR、磷酸化 p70S6K和磷酸化4E-BP1蛋白表达水平

原代培养的皮质神经元，经各种药物处理不同时间后，用BCA法测定蛋白质含量。用10%～12%SDS-PAGE凝胶中的蛋白质电转移至硝酸纤维素膜上，封闭。将膜放入一抗中(1∶1000)，4℃过夜。TTBS冲洗后，将膜放入二抗(1∶1000)中，室温孵育1～2 h，TTBS洗膜后将膜在SuperSignal West Pico底物工作液中孵育5 min，吸干多余试剂，放置化学发光凝胶系统分析仪中进行Ecl化学发光。测定磷酸肌醇依赖激酶 1(phosphoinositide-dependent kinase-1，p-PDK1)，p-Akt(Ser473)，p-mTOR，p-p70S6K和p-4E-BP1。利用Visionworks 6.3.3图像采集及分析软件对蛋白带进行分析。实验重复3次。

2 结果

2.1 阿托伐他汀对培养皮质神经元突起发育的影响

倒置相差显微镜结果(图1)显示，Ato 10 μmo·lL－1可明显促进神经元突起生长，表现为突起分支总长度明显增加、一级突起数目明显增多、末端分支数明显增多及胞体面积增大(图1B1和图2)。PI3K阻断剂 LY29400230 μmol·L－1可明显阻断 Ato 对神经元突起生长的促进作用(图1B2和图2)，说明Ato的这种作用与PI3K通路有关。PI3K下游激酶Akt阻断剂 TCBN 2.5 μmol·L－1也能完全阻断 Ato这种作用(图1-B3和图2)，说明与PI3K和Akt通路有关。Ato这种作用也能被mTOR阻断剂西罗莫司 100 nmol·L－1所阻断(图 1-B4 和图 2)，说明了Ato可能主要是通过PI3K/AKT/mTOR信号转导通路促进突起发育。单独应用TCBN 2.5 μmol·L－1对神经元突起生长也有抑制作用。

2.2 阿托伐他汀对皮质神经元p-PDK1和p-Akt蛋白表达水平的影响

Fig.2 Effect of Ato on dendritic complexity in cultured cortical neurons.See Fig.1 for the legend.TDBL:total dendritic branch length.Con:control;LY:LY29402;TCBN:triciribine.±s，n=30.*P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control group;#P＜0.05，##P＜0.01，compared with Ato alone group.

Fig.3 Effect of Ato on phosphorylated phosphoinositide-dependent kinase-1(p-PDK1)in cultured rat cortical neurons by Western blotting.See Fig.1 for the legend.B was the semiquantitative result of A.Lane 1:normal control;lane 2:Ato 10 μmo·lL－1;lane 3:LY294002+Ato;lane 4:LY294002.±s，n=3.＊＊ P＜0.01，compared with normal control group;##P＜0.01，compared with Ato 10 μmol·L －1group.

与正常对照组相比，Ato 10 μmol·L－1组可明显增加神经元 p-PDK1(图3)和 p-Akt(Ser473)(图4)的蛋白表达水平。LY294002可明显抑制Ato引起的p-PDK1和p-Akt(Ser473)的蛋白表达水平增加。单独应用LY294002能使神经元p-Akt(Ser473)蛋白表达水平降低。但未能使p-PDK1蛋白表达水平降低达到统计学意义。

2.3 阿托伐他汀对皮质神经元p-mTOR蛋白表达水平的影响

与正常对照组相比，Ato 10 μmol·L－1组可明显增加神经元p-PDK1和p-Akt(Ser473)的蛋白表达水平。TCBN可明显抑制Ato引起的p-mTOR的蛋白表达水平增加。单独应用TCBN能使神经元p-mTOR蛋白表达水平明显降低(图5)。

Fig.4 Effect of Ato on p-Akt protein levels in cultured rat cortical neurons by Western blotting.See Fig.1 for the legend.B was the semiquantitative result of A.Lane 1:normal control;lane 2:Ato 10 μmol·L －1;lane 3:LY294002+Ato;lane 4:LY294002.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal control group;##P＜0.01，compared with Ato alone group.

2.4 阿托伐他汀对皮质神经元 p-p70S6K和p-4E-BP1蛋白表达水平的影响

与正常对照组相比，Ato 10 μmol·L－1组可明显增加神经元 p-p70S6K(图6A1，B1)和 p-4E-BP1(图6A2，B2)的蛋白表达水平。西罗莫司可明显抑制Ato引起的p-p70S6K和p-4E-BP1的蛋白表达水平增加。单独应用西罗莫司能使神经元p-4E-BP1蛋白表达水平降低。但未能使p-p70S6K蛋白表达水平降低达到统计学意义。

Fig.5 Effect of Ato on phosphorylated mammalian target of rapamycin(p-mTOR)protein levels in cultured rat cortical neurons by Western blotting.See Fig.1 for the legend.B was the semiquantitative result of A.Lane 1:control;lane 2:Ato 10 μmol·L －1;lane 3:tricirbine+Ato;lane 4:tricirbine.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal control group;##P＜0.01，compared with Ato group.

Fig.6 Effect of Ato on phosphorylated ribosomal S6-kinase(p-p70S6K，A)and phosphorylated eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1(p-4E-BP1，B)levels in cultured rat cortical neurons by Western blotting.See Fig.1 for the legend.A2 and B2 were the semiquantitative results of A1 and B1，respectively.Lane 1:normal control;lane 2:Ato 10 μmol·L －1;lane 3:sirolimus+Ato;lane 4:sirolimus.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal control group;##P＜0.01，compared with Ato alone group.

3 讨论

本研究结果显示，Ato促进神经元突起发育的作用与已发现的PI3K/Akt/mTOR信号转导通路有关，首先Ato可明显促进神经元突起生长，表现为突起分支总长度明显增加、一级突起数目明显增多、末端分支数明显增多及胞体面积增大。应用PI3K阻断剂LY294002可明显阻断Ato对神经元突起生长的促进作用，说明Ato的这种作用与PI3K通路有关。PI3K下游激酶Akt阻断剂曲西立滨也能完全阻断Ato这种作用，说明与PI3K/Akt通路有关。Ato这种作用也能被mTOR阻断剂西罗莫司所阻断，推测Ato可能主要是通过PI3K/AKT/mTOR信号转导通路促进突起发育。此外，应用PI3K阻断剂LY294002阻断PI3K/Akt信号转导通路，再加入Ato，Ato可以对抗LY294002所致的PI3K下游蛋白p-PDK1和p-Akt473表达的减少，应用西罗莫司阻断Akt/mTOR信号转导通路，同样Ato可以对抗西罗莫司所致的Akt下游蛋白p-mTOR表达的减少，Ato这种作用也能被mTOR阻断剂西罗莫司所阻断，西罗莫司可明显阻断Ato引起的p-p70S6K和p-4E-BP1蛋白表达水平增加。因此，该结果也能进一步支持我们的推测。

PI3K/Akt/mTOR这个经典的信号转导通路，可被数个跨膜受体和配体结合所产生的细胞信号所激活，如胰岛素样生长因子、神经生长因子、神经营养因子、血小板源性生长因子和某些药物等[13－15]，通过与其受体结合激活细胞内的突变胰岛素受体酶解物[16]，激活PI3K，活化后的PI3K磷酸化细胞膜上的磷脂酰肌醇生成PIP2和PIP3，生成的磷脂产物通过结合蛋白的PH结构域，使PDK1和Akt都被结合到膜上，PDK1进一步激活Akt(Thr308)。Akt是PI3K信号转导通路中一个重要的下游靶激酶，活化的Akt可以直接磷酸化mTOR，哺乳动物mTOR是Akt信号转导通路中一个重要的下游靶激酶，通过多种途径调节细胞增殖、分化和生长。活化后的Akt蛋白再转位到胞浆中或胞核内，通过对一系列底物的磷酸化，使其下游的mTOR被激活，活化的mTOR通过磷酸化激活下游两个重要的靶蛋白。p70S6K和4E-BP1是mTOR下游两个重要的靶蛋白，它们分别启动蛋白质的翻译和促进蛋白质的合成，继而对细胞生长和代谢进行调控[11]，本研究结果显示，Ato能对抗通路PI3K/Akt/mTOR下游相关蛋白质的减少，从而促进神经元突起发育。

为进一步阐明阿托伐他汀在中枢神经系统的药理作用提供了新的实验依据，同时也为他汀类药物开拓出新的广阔治疗方向。

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