高效液相色谱-串联质谱法检测蔬菜、水果中阿维菌素、甲维盐残留

吴宇宽,赵静,高进,唐澈,余静

(湖北省农产品质量安全检测中心,湖北 武汉 430070)

0 引言

阿维菌素(avermectin)和甲维盐(甲氨基阿维菌素苯甲酸盐,emamectin)属大环内酯类抗生素,致毒机理独特,是高效、广谱的新型抗生素类杀虫杀螨剂,对线虫和节肢动物驱杀效果好,在国内广泛应用于蔬菜和水果虫害的防治[1-2].但阿维菌素和甲维盐的过量使用使其在农产品中高残留,害虫已产生抗药性,因此各国都已限量使用.由于阿维菌素和甲维盐属于脂溶性药物,在动物体内的残留时间较长[3].根据世界卫生组织(WHO)的5级分类标准,阿维菌素和甲维盐被列为高毒化合物.欧盟规定最大残留限量值为0.01 mg/kg[4],我国规定的最大残留限量值为0.02～0.05 mg/kg[5].

目前检测阿维菌素和甲维盐的主要方法有免疫分析法[6]、高效液相色谱-荧光检测法等[7-9].免疫分析法方便、快捷,适合大批量样品筛选,但是不能确定具体的药物类型,且存在假阳性的现象,不能作为确证方法.高效液相色谱-荧光检测法应用较多,方法检出限较低,能达到检测要求,但是需要繁琐的衍生化反应.近年来,高效液相色谱-质谱联用技术开始应用于阿维菌素类药物残留的检测,此方法对前处理要求不高,灵敏度高,且同时可以排除假阳性、避免基质效应,定量准确[10-12].

本文中采用高效液相色谱-加热电喷雾串联质谱法(HPLC/HESI-MS/MS),建立了同时测定蔬菜、水果中阿维菌素和甲维盐的方法.该方法快速、高效、灵敏度高、重复性好,适用于蔬菜、水果中阿维菌素和甲维盐的分析确证.

1 材料与方法

1.1材料与试剂阿维菌素和甲维盐标准品,纯度均为99%(德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司);甲酸、甲醇、乙腈、二氯甲烷和乙酸铵,均为色谱纯(美国J.T.BAKER公司);氯化钠(NaCl),分析纯(上海国药集团公司);实验用水为超纯水,由Milli-Q系统(美国Millipore公司)制得.

1.2仪器与设备TSQ Quantum Ultral EMR液相色谱-质谱联用仪,配有加热电喷雾电离源(美国Thermo公司);T25高速分散机(德国IKA公司);3K15高速离心机(德国Sigma公司);固相萃取小柱:Amino Box(500 mg,6 mL)(美国Agilent公司).

1.3标准溶液配制称取10.0 mg阿维菌素或者甲维盐标准品于100 mL棕色容量瓶中,用甲醇定容,配制成100 mg/L标准储备液,保存于4 ℃冰箱中,使用时用基质空白溶液稀释成适当浓度的标准工作液.

1.4 样品前处理

1.4.1 提取 对8种蔬菜、水果进行实验,分别为西红柿、芹菜、花菜、四季豆、韭菜、白菜、梨和苹果.将样品按4分法取样,置于食物料理机中打碎,然后装入样品盒,在-20 ℃下保存.实验前将样品盒取出放至常温,用50 mL离心管称取10 g样品,加入20 mL乙腈,在高速分散机上以10 000 r/min的转速匀浆2 min,再在离心机上以5 000 r/min离心10 min,另取一50 mL离心管,加入约3 g NaCl,将上清液倒入此离心管,加盖振摇1 min,静置30 min,取10 mL上层有机相于10 mL离心管中,在70 ℃水浴下用氮气吹至近干.

1.4.2 净化 先用4 mL甲醇/二氯甲烷(5/95,v/v,全文同)溶液预淋洗活化Amino SPE柱,再依次用4、4、2 mL的甲醇/二氯甲烷(5/95)溶液分3次加入10 mL样品离心管中,漩涡仪震荡,过Amino SPE柱洗脱,用10 mL离心管收集洗脱液,于50 ℃的水浴中氮吹至近干,加入3 mL甲醇,在涡旋仪上涡旋0.5 min,再用水定容至5 mL,混匀后过0.2 μm有机滤膜,待测.

1.5 色谱-质谱条件

1.5.1 色谱条件 色谱柱:Thermo Hypersil Gold C18,100 mm×2.1 mm,5 μm(i.d.);流动相:A为

表1 阿维菌素和甲维盐的母离子、子离子及碰撞能量

*定量离子

甲醇(含0.1%甲酸),B为0.2%乙酸铵;柱温:35 ℃;进样量:10 μL;流速:200 μL/min;运行时间:10 min.

1.5.2 质谱条件 质谱条件:加热电喷雾离子源(HESI),正离子模式采集;扫描模式:SRM;干燥气:氮气;鞘气/辅助气:30/10 units;离子传输管温度:270 ℃;喷雾电压:3 000 V.其他参数见表1.

2 结果与分析

2.1样品的净化采用固相萃取法净化,常用的固相萃取小柱有氨基柱(洗脱液为甲醇∶二氯甲烷=95∶5)、氟罗里硅土柱(洗脱液为丙酮∶正己烷=10∶90)、石墨碳黑氨基串联柱(洗脱液为乙腈∶甲苯=3∶1).本实验比较了几种萃取柱的净化效果和回收率,结果表明:氟罗里硅土柱和石墨碳黑氨基串联柱对目标物的吸附能力较强,难以洗脱,造成回收率偏低,而氨基柱的回收率均在70%～110%之间,同时正己烷和甲苯的毒性较大,尽量避免使用,因此选用氨基柱作为萃取柱,洗脱体系为甲醇-二氯甲烷(95∶5).

2.2检测条件的优化在正离子模式检测条件下对1 mg/L的阿维菌素和甲维盐标准溶液以流动注射的方式进行母离子扫描,确定其分子离子,然后在选择反应监测模式下自动优化,再对子离子进行全扫描.选择丰度较高、干扰较少的两个子离子为定性离子,丰度最高的离子作为定量离子,优化其碰撞能.优化后得到的质谱条件见表1.

图1 阿维菌素和甲维盐标准溶液的选择反应监测谱图

流动相的组成对LC-MS/MS测定的灵敏度和色谱峰的分离度有很大影响,通常使用有一定酸度的流动相以使被分析物容易质子化而带正电荷,从而提高检测的灵敏度.在流动相中加入0.1%甲酸溶液时,分离效果良好,峰形得到改善,质谱响应值较高,同时,在流动相中加入乙酸铵可促进母离子的形成.本实验以0.1%的甲醇-0.2%的乙酸铵作为流动相,结果表明,可得到较好的峰形和分离效果.在上述优化的条件下,阿维菌素和甲维盐标准溶液的选择反应监测谱图见图1,从中可以看出阿维菌素和甲维盐的峰形和分离度较好,峰值较高,分析时间较短.

2.3标准曲线和检出限在西红柿样品中加入一系列不同浓度的阿维菌素和甲维盐标准溶液,配制成质量浓度为5～50 μg/L的基质标准溶液,按试验方法处理样品,按仪器工作条件进行测定,以质量浓度为横坐标x、峰面积为纵坐标y绘制标准曲线,并求得回归方程和相关系数.阿维菌素和甲维盐在5.0～50.0 μg/L范围内具有良好的线性关系,相关系数均大于0.995(见表2).以样品空白信噪比(S/N)的10倍计算检出限,阿维菌素和甲维盐的检出限均为2 μg/kg.

表2 阿维菌素和甲维盐的线性方程、相关系数、线性范围

2.4回收率与精密度在所检测的8个样品中分别加入5.0、10.0和20.0 μg/kg各3个浓度水平的阿维菌素和甲维盐标准溶液,进行回收率实验,每个水平重复测定6次,平均回收率范围为72.3%～108.6%,相对标准偏差(RSD)为3.6%～12.6%(表3).

3 结论与讨论

本文中采用乙腈高速匀浆提取样品,氨基固相萃取柱净化,在加热电喷雾离子源正离子模式采集、三重四级杆质谱仪选择性反应监测模式下,对蔬菜、水果中阿维菌素和甲维盐药物残留进行了测定.该方法前处理简单,灵敏度、准确度、精密度均较高,各种指标符合残留检测的相关要求,可用于蔬菜、水果中阿维菌素和甲维盐残留的检测.

表3回收率和精密度试验结果(n=6)

续表3

样品阿维菌素甲维盐加入量/(μg/kg)回收率/%RSD/%加入量/(μg/kg)回收率/%RSD/%5.077.07.35.076.98.2芹菜10.085.88.410.079.66.420.0102.25.520.082.37.15.083.711.05.088.45.8花菜10.079.16.310.093.67.520.096.56.220.0105.36.65.077.28.95.082.49.6四季豆10.086.85.710.078.38.720.095.46.420.094.09.15.076.57.75.072.39.6韭菜10.083.28.610.081.412.620.088.75.920.086.56.55.082.68.45.086.57.2白菜10.091.38.210.090.88.420.0108.65.720.0106.43.65.079.65.85.085.710.6梨10.084.18.010.092.86.520.096.39.320.0102.88.55.078.28.75.083.38.0苹果10.084.69.510.089.66.220.093.86.120.096.67.1

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