Rho／Rho激酶在COPD大鼠气道的表达及其对气道重塑的影响

曾建红，黄健莹，曾军，胡广奋

（广州市第一人民医院，广州 510180）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一种常见病、多发病，病死率高，社会经济负担重。气道炎症和气道重塑是COPD主要的病理生理学特征，研究其病理改变及发生机制对增强其防治效果及改善患者预后具有重要意义［1］。Rho／Rho 激 酶 （Rho－associated coiled－coil forming kinase，ROCK）信号通路是机体各组织细胞普遍存在的一条信号转导通路。Rho／Rho激酶信号通路参与了COPD的发病过程，Rho激酶抑制剂可抑制炎症细胞的迁移和趋化、拮抗炎性因子分泌、阻断炎性因子作用，从而发挥抗炎作用，改善气道重塑［2］。本课题主要研究ROCK信号通路在COPD大鼠模型气道中的表达及其对气道重塑的作用。通过建立COPD大鼠动物模型，分析ROCK信号通路在COPD大鼠气道中的表达及其对支气管壁厚度（Wat）和平滑肌厚度（Wam）的影响，探讨ROCK信号通路在COPD大鼠气道重塑中的作用，为临床防治COPD提供依据。

1 资料与方法

1.1 动物模型的分组与建立

清洁级相同重量级Wistar大鼠60只，随机分为正常对照组、COPD组、Y－27632干预组，每组20只。3组大鼠在相同的环境下采用相同的喂养方式。对照组为正常大鼠，饲养至90d；COPD组采用香烟雾熏加脂多糖（LPS）气管滴入方法复制大鼠COPD模型：分别于试验的第1、8、15、23天将LPS 200μg／200μL注入大鼠气管内，于第2～7天和第9～14天将上述处理后的大鼠放入熏箱内，1次／d，每次被动吸烟（双喜牌）4支，持续30min；连续2w后，停止香烟染毒，继续饲养至90d。Y－27632干预组在建立COPD大鼠模型过程中，试验的第1、8、15、23天将LPS 200μg／200μL注入大鼠气管内1 h后，每次腹腔注射Y－27632溶液0.1mL，同样饲养至90d。

1.2 肺组织标本留取、制作及观察

第91天处死大鼠后，即刻打开胸腔，暴露肺组织，观察肺组织大体改变后，剪切左肺肺门中下肺段，用4%多聚甲醛固定4～6h，脱水、包埋、切片，常规HE染色，光镜下观察支气管及血管周围的炎症细胞浸润情况。左肺门上段肺组织迅速置于液氮，－80℃保存备用。

1.3 Wat和 Wam测量

每只大鼠挑选3～5支有完整横断面的中小支气管，采用Image－proplus图像分析软件测量肺内支气管基底膜周径（Pbm）、支气管总面积（Wat1）、管腔面积（Wat2）、平滑肌外缘内气管面积（Wam1）、平滑肌内缘内气管面积（Wam2），并用Pbm 标准化，即 分 别 以 （Wat1－Wat2）／Pbm 和 （Wam1－Wam2）／Pbm来表示 Wat和 Wam。

1.4 肺组织中ROCKⅡ蛋白表达检测

采用免疫组织化学SABC法（链霉亲和素－生物素－过氧化物酶复合物法），严格按上海生工生物工程技术有限公司订购的试剂盒说明书操作进行。

1.5 肺组织RhoA，ROCKⅡmRNA表达检测

采用RT－PCR法，采用异硫氰酸胍－苯酚－氯仿法提取大鼠肺组织RNA，反应体系按试剂盒说明书加入引物、RNA样品、Taq酶，加无菌双蒸水使反应体系达到50μL，逆转录条件为38℃30min，取2 μL逆转录产物进行PCR反应，反应条件为94℃预变性2min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃ 延伸30s，35个循环，72℃再延伸5min，取5μL产物在浓度为2%的琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像系统分析处理，计算灰度值［3］。

1.6 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，3组间的差异性比较运用单因素方差分析，采用LSD进行组间的两两比较，检验标准为0.05。

2 结果

2.1 各组大鼠的Wat和Wam对比

与对照组相比，COPD组和Y－27632干预组大鼠支气管的Wat和Wam都明显增高，且差异具有统计学意义（P＜0.05）；Y－27632 干预组大鼠与COPD组大鼠相比，Wat和Wam都有明显降低，且差异具有统计学意义（P＜0.05）（见表1）。

表1 各组大鼠的Wat和Wam对比

2.2 RhoA，ROCKⅡmRNA在各组大鼠肺组织中的表达比较

ROCKⅡ蛋白在COPD组和Y－27632干预组大鼠中的表达与对照组相比均有所增高，且差异具有统计学意义（P＜0.05）；与COPD组相比，ROCKⅡ蛋白在Y－27632干预组大鼠的肺组织中表达量有所降低，且差异具有统计学意义（P＜0.05）；RhoA mRNA和ROCKⅡmRNA表达具有一致性，与对照组相比，RhoA，ROCKⅡmRNA在COPD组和Y－27632干预组中的表达均有所增高，且差异存在统计学意义（P＜0.05）；与 COPD组相比，RhoA，ROCKⅡmRNA的表达在Y－27632干预组中又有明显的降低，且差异具有统计学意义（P＜0.05）（见表2）。

表2 RhoA，ROCKⅡmRNA在各组大鼠肺组织中的表达比较

3 讨论

COPD的主要特征为气道炎症和气道重塑，在COPD患者中，支气管肺组织的炎症、损伤、修复和重塑是一个不断进展的病理过程。气道炎症是COPD的起始阶段，气道重塑是COPD气流阻塞的病理基础，是COPD病变持续发展的关键因素。因此，研究其病理改变及发生机制对增强其防治效果及改善患者预后具有重要意义。气道平滑肌细胞不仅是气道重塑重要的效应细胞，而且还主动参与气道的炎症反应。Rho／Rho激酶信号通路是机体各组织细胞普遍存在的一条信号转导通路。它通过调节细胞肌动蛋白骨架的聚合状态，参与调控细胞形态维持、细胞黏附与迁移、细胞增殖与凋亡、基因转录、平滑肌收缩等多种生物学行为，介导了多种平滑肌与非平滑肌功能异常相关疾病的发生机制，是近年来研究的热点之一。Rho激酶通过激活ROCK作用于气道的平滑肌细胞，或调节细胞因子和炎性因子等的产生，影响气道重塑的发生和进展。COPD患者气道均有不同程度的增厚，从而导致气道的狭窄，主要原因有气道平滑肌的增生、肥大，或是基底膜增厚，从而导致气道的阻塞和高反应性。有研究［4］显示，在多种疾病气道高反应性动物模型研究中均发现其支气管的平滑肌细胞中Rho激酶的表达明显增加，由此更加说明Rho／Rho激酶信号通路与气道的重塑存在着密切的关系。平滑肌细胞的活化和增殖是气道高反应和气道重塑的主要原因。有研究表明ROCKⅡ特异性拮抗剂Y－27632能减少哮喘小鼠气道壁和气道平滑肌的增殖程度，抑制与平滑肌增殖相关的信号通路的关键分子RhoA、ROCKⅡ的表达，从而抑制气道重塑。Rho／Rho激酶信号通路参与了COPD的发病过程，Rho激酶抑制剂可抑制炎症细胞的迁移和趋化、拮抗炎性因子分泌、阻断炎性因子作用，从而发挥抗炎作用，改善气道重塑。

本研究结果显示COPD组大鼠RhoA，ROCKⅡmRNA 表达明显增高，而 Y－27632干预组RhoA，ROCKⅡmRNA表达相对于COPD组有所降低（P＜0.05），因此说明应用ROCKⅡ特异性拮抗剂Y－27632能够下调RhoA，ROCKⅡmRNA表达；同时ROCKⅡ特异性拮抗剂Y－27632能有效干预大鼠的气管壁增厚和平滑肌增殖，结果显示Y－27632干预组大鼠的Wat、Wam明显低于COPD组大鼠（P＜0.05）。RhoA，ROCKⅡmRNA的表达与大鼠支气管 Wat、Wam的改变具有一致性，说明Rho激酶抑制剂Y－27632能够抑制RhoA，ROCKⅡmRNA的表达和平滑肌细胞的增生，从而有效地改善气道重塑。

综上所述，Rho／ROCK信号转导通路与气道的重塑存在密切的关系，通过进一步研究Rho／ROCK信号转导通路在气道重塑中的作用和机制，有助于我们对COPD发病机制的认识，为COPD的基础研究和临床防治工作提供新的理论依据和防治措施。

［1］Taki F，Kume H，Kobayashi T，et al.Effects of Rho－kinase inactivation on eosinophilia and hyper－reactivity in murine airways by allergen challenges［J］.Clinical ＆ Experimental Allergy，2007，37（4）：599－607.

［2］Vardouli L，Vasilaki E，Papadimitriou E，et al.A novel mechanism of TGFβ－induced actin reorganization mediated by Smad proteins and Rho GTPases［J］.FEBS Journal，2008，275（16）：4074－4087.

［3］项蔷薇，朱妍艳，罗运春，等.Rho／Rho激酶在哮喘小鼠气道的表达及其对气道重塑的影响［J］.浙江医学，2011，33（8）：1127－1129.

［4］Jiao X，Katiyar S，Liu M，et al.Disruption of c－Jun reduces cellular migration and invasion through inhibition of c－Src and hyperactivation of ROCK II kinase［J］.Mol Biol Cell，2008，19（4）：1378－1390.