CpG岛靶向siRNA诱导P16沉默的甲基化分析

杨晓红，黄孝天，朱伟锋，刘卓琦，余乐涵，李 华，王 晟，罗达亚*

(南昌大学1.基础医学院;2.医学实验教学部，江西南昌330006)

DNA甲基化是在不改变DNA序列的前提下表观遗传调控基因的重要方式之一，在细胞分化、X染色质失活、寄生性DNA防御以及基因印迹等方面发挥重要的生理作用［1－2］。CpG岛是在哺乳动物基因组中CpG含量大于50%，长度超过200 bp的DNA片段。现今发现，60%以上基因的启动子含有CpG岛，且其主要位于基因的启动子和第一外显子区域，该区域的CpG位点甲基化状态常常影响基因的转录，并与肿瘤的发生、发展密切相关［3］。在病毒感染的烟草类植物中，双链RNA能诱导互补序列的甲基化，这种被称为RdDM的现象在转基因植物中也存在［4－6］。该机制的发现为高等动物细胞中基因甲基化的诱导机制研究开辟了新的道路。

1 材料与方法

1.1 寡核苷酸引物与siRNA

胃癌细胞系 MGC803、BGC823及肠癌细胞系RKO(北京肿瘤医院病因室邓大君教授馈赠)。寡核苷酸引物(北京奥科生物技术有限责任公司合成)。siRNA(siR)均参照上海吉凯基因化学技术有限公司标准设计并合成。siR-P靶向P16启动子转录起始点上游－26～－8位，siR-E靶向转录起始点下游第一外显子+329～+347位。引物与siRNA序列见表1，2。

1.2 siRNA转染与细胞RNA、蛋白质、DNA的提取

细胞转染分乱序siRNA转染组(siR-C)、靶向启动子siRNA转染组(siR-P)与靶向第一外显子siRNA转染组(siR-E)3组，按照 LipofectamineTM2000试剂盒说明进行，各组siRNA的转染终浓度均为50 nmol/L。转染96 h后收集细胞并按照Trizol试剂盒说明提取RNA、蛋白质与DNA。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primers

表2 siRNA序列Table 2 Sequences of siRNAs

1.3 RNA的反转录与RT-PCR

反转录合成操作按照ImProm-ⅡTMReverse Transcription System试剂盒说明进行。GAPDH与P16 mRNA半定量PCR分析选择北京鼎国生物技术有限公司的 PCR反应体系，反应条件:95℃ 5 min→(95℃ 40 s→56℃ 40 s→72℃ 40 s)×27个循环→72℃ 10 min。20 g/L琼脂糖凝胶电泳后凝胶成像系统摄片，ChemiImager 5500软件进行半定量分析。

1.4 免疫印迹

免疫印迹按常规操作，选择的一抗为1∶5 000的兔抗人 β-actin多克隆抗体(I-19，sc-1616-R)和1∶1 000的小鼠抗人 P16单克隆抗体(JC2，MS-887-P0)，二抗为1∶50 000的辣根酶标志山羊抗兔 IgG(ZB-2301)和1∶50 000的辣根酶标志山羊抗小鼠IgG(ZB-2305)。X线片扫描后，ChemiImager 5500软件进行半定量分析。

1.5 细胞DNA的亚硫酸氢钠修饰、纯化与甲基化特异性PCR(MSP)

DNA的亚硫酸氢钠修饰按常规操作，纯化步骤按照Wizard DNA Clean-up System试剂盒说明进行。选择Qiagen PCR体系进行MSP分析，PCR反应条件:95℃ 15 min→(95℃ 40 s→56℃ 40 s→72℃40 s)×35个循环→72℃ 10 min。20 g/L琼脂糖凝胶电泳。

1.6 通用引物PCR、PCR产物的纯化、TA克隆与克隆测序

选择分别针对启动子与外显子区域的UP与UE通用引物，使用Qiagen PCR体系进行扩增，PCR反应条件:95℃ 15 min→(95℃ 40 s→70℃ 60 s，－1.0℃/cycle→72℃ 60 s)×10个循环→(95℃40 s→60℃ 60 s→72℃ 60 s)×30个循环→72℃10 min。通用引物PCR产物的纯化操作按照离心柱型DNA产物纯化试剂盒说明进行;TA克隆实验操作按照pCF-T连接试剂盒说明进行。常规细菌转化后各挑取10个克隆测序。

2 结果

2.1 半定量RT-PCR检测siRNA转染BGC823细胞的P16 mRNA表达

与siR-C组相比，靶向启动子区域的siR-P能微弱降低P16基因的表达，而靶向外显子区域的siR-E能显著下调P16基因的表达(图1)。

图1 siRNA转染BGC823细胞96 h后P16/GAPDH的RT-PCR分析Fig 1 RT-PCR analysis of P16/GAPDH in BGC823 cells 96 hours after transduction of siRNA

2.2 免疫印迹分析siRNA转染BGC823细胞的P16蛋白表达

与siR-C组相比，靶向启动子区域的siR-P能微弱降低P16蛋白的表达，而靶向外显子区域的siR-E能显著下调P16基因的表达(图2)。

图2 siRNA转染BGC823细胞96 h后P16/β-actin的免疫印迹分析Fig 2 Immunoblotting analysis of P16/β-actin in BGC823 cells 96 hours after transduction of siRNA

2.3 甲基化特异性PCR(MSP)分析

胃癌细胞系MGC803显示P16为非甲基化;结肠癌细胞系RKO显示P16为甲基化。siR-C、siR-P及siR-E组的BGC823细胞均为P16非甲基化(图3)。

2.4 通用引物PCR扩增

选择分别针对启动子区域及第一外显子区域的通用引物扩增，得到368 bp及392 bp的产物(图4)。

2.5 通用引物PCR扩增产物的克隆测序

图3 siRNA转染BGC823细胞96 h后P16启动子区MSP分析Fig 3 MSP analysis of P16 promotor region in BGC823 cells 96 hours after transduction of siRNA

图4 包含siR-P与siR-E互补序列的368 bp与392 bp的扩增产物Fig 4 PCR amplicons of 368 bp and 392 bp containing siR-P and siR-E complementary sequences

10个克隆测序结果显示，siR-P与siR-E分别转染的BGC823细胞中，siR-P对应的序列中2个CG位点及周围23个CG位点均未发生甲基化(图5，7);siR-E对应的序列中3个CG位点及周围32个CG位点均未发生甲基化(图6，7)。

3 讨论

P16基因CpG岛跨越其启动子与第一外显子区域，包含5个CG富含区［7］。P16基因常因该区域甲基化失活而与多种肿瘤的发生、发展有关［8－9］。尽管P16基因甲基化作为肿瘤分子标志物已应用于肿瘤研究与个体化临床分析中，然而，P16基因甲基化诱导调控的机制尚不清楚。

siRNA转染BGC823细胞系的半定量RT-PCR、免疫印迹检测结果显示，P16基因的mRNA与蛋白质水平均有不同程度的下调，变化趋势一致。联合应用两种方法检测后的结果显示，siR-P和siR-E均不能诱导其互补序列以及邻近的CpG位点甲基化，提示靶向P16基因CpG岛的siRNA不能通过诱导甲基化的方式沉默基因表达。这与部分研究成果一致。研究表明，分别针对Huntington基因外显子和Mos基因编码区域设计合成的表达长链shRNA的质粒可以有效沉默目的基因的表达，但不能诱导同源基因组和质粒序列中的CpG和临近非CpG位点胞嘧啶甲基化［10－11］。然而，分别针对 EF1A 和E-cad启动子区域设计的siRNA可以有效地沉默EF1A和E-cad的表达，并可以甲基化基因组中同源序列的CpG位点，且这两种作用都可以被 DNA甲基化阻断剂5-azaC所阻断［12－13］。另有研究发现，甲基化的寡核苷酸序列可以通过募集DNMT1等蛋白而靶向诱导BCL-2启动子的同源序列甲基化，而非甲基化的寡核苷酸序列却没有该作用［14］。在哺乳动物细胞中开展的类似研究说明，RdDM机制可能因靶向基因、siRNA靶向序列、siRNA的修饰状态及转染细胞类型等多因素存在密切的联系。尽管该实验中针对CpG岛设计的两对siRNA均未诱导出P16基因甲基化，但是否可能通过诱导表遗传学其他机制的改变而调控基因表达仍值得深入研究。研究发现，靶向孕激素受体启动子区域的miR-423-5p mimic在转染乳腺癌细胞系MCF7与T47D后，并不能诱导靶向区域的DNA甲基化，却能通过诱导H3K9Me2的组蛋白修饰方式沉默基因表达［15］。这也为后续非编码RNA的转录水平调控研究提供了方向。

综上所述，本实验设计的靶向P16基因启动子与外显子区域的siRNA，能下调BGC823细胞系P16基因的表达，但不能诱导同源序列的DNA甲基化。

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