不同产地火棘果实黄酮体外抗氧化作用

李 伟，程 超

(湖北民族学院 生物科学与技术学院，湖北 恩施445000)

火棘(Pyracantha fortuneana(Maxim．)Li)为蔷薇科苹果亚科火棘属常绿野生灌木果树植物，产区均可以果实代替粮食．火棘属植物主要分布在我国西南地区，以湖北、四川、贵州等省产量较大［1－2］．

有关火棘的研究重点在火棘的组织培养、观赏园艺及功能作用方面［3－4］，同时前期研究发现火棘果黄酮具有很强的抗氧化效果［5］，但目前对恩施州不同地区火棘功效成分及功能作用的研究较少研究报道． 因此本文主要以湖北省恩施州不同海拔地区、不同成熟期的火棘果实中的黄酮为分析指标，对其进行初步分离纯化，并对不同产区的黄酮的抗氧化作用进行了研究，期望本研究可为火棘优良种质的选育方面提供新的信息资料．

1 材料与方法

1．1 试验材料

火棘果实:试验材料共有6 种，如表1 所示． 以下编号代表种类与此相同．

表1 火棘果原料产地及特征Tab．1 The place and characteristics of raw materials from Pyracantha fortuneana Fruits

1．2 试验试剂

芦丁标准品(上海研生实业有限公司);DPPH(上海化学工业发展有限公司);AB－8、D－101、NKA－II 型大孔树脂(天津欧瑞生物科技有限公司)．

乙醇、石油醚、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、浓硫酸、苯酚、浓盐酸、没食子酸、三烃甲基氨基甲烷，均为国药集团化学试剂有限公司，分析纯．

1．3 试验仪器

DL－5 低速大容量离心机(上海安亭科学仪器厂);RE－52 旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);DHL－A电脑恒流泵(上海沪西分析仪器厂);TH－1000 梯度混合器(上海沪西分析仪器厂);层析柱:1．6×50 cm(上海沪西分析仪器厂);DBS－100 电脑全自动部分收集器(上海沪西分析仪器厂);756MC 紫外可见光分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)．

1．4 试验方法

1．4．1 火棘果黄酮提取工艺流程 参照文献［6］，略有修改，准确称取10 g 原料，按料液比1 ∶5 加入石油醚，回流脱色脱脂1 h，4 800 r/min 离心15 min，收集沉淀自然干燥，将干燥粉末用1 ∶25 料液比在80℃下用90%乙醇溶液回流提取3 h，4 800 r/min 离心15 min，取上清液浓缩后冷冻干燥即可．

1．4．2 黄酮含量测定 分别吸取0．5 mg/mL 芦丁标准溶液0、0．4、0．8、1．2、1．6、2．0 mL 于10 mL 容量瓶中，加5% NaNO2溶液0． 3mL，放置6 min，再加10%Al(NO3)3溶液0．3 mL，放置6 min，加4%NaOH 溶液4．0 mL，加水至刻度，摇匀，放置15 min，于510 nm 测吸光度［7］．以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线并得线形回归方程为y=－0．004 9+1．072 1x，R2=0．999 6．

其中:V:黄酮溶液总体积(mL);W:火棘果黄酮重量(g)．

1．4．3 黄酮的分离纯化

1．4．3．1 大孔树脂预处理 分别称取10 g AB－8、D－101、NKA－Ⅱ型大孔树脂，用95%乙醇浸泡24 h，充分溶胀后，抽滤，蒸馏水反复冲洗至中性;再用5% NaOH 浸泡3 h，再用蒸馏水洗至中性;用5% HCL 溶液浸泡3 h，再用蒸馏水洗涤至中性备用［8－9］．

1．4．3．2 大孔树脂筛选 称取1．0 g 经处理好的树脂于50 mL 烧杯，加入质量体积分数为C0的黄酮提取液10 mL，室温搅拌2 h，4 800 r/min 离心15 min，得上清液1，测其黄酮质量体积分数为C1．取出吸附饱和的树脂加入10 mL 体积分数为90%乙醇洗脱，同样温度下搅拌2 h，离心，得上清液2，测其黄酮质量体积分数C2，分别以吸附率和解吸率为参考指标进行树脂优化［8－9］．

式中:C0为黄酮提取液质量体积分数，mg/mL;C1为树脂吸附后剩余溶液质量体积分数，mg/mL;C2为洗脱液质量体积分数，mg/mL;V为加入黄酮体积;V1为上清液1 的体积;V2为上清液2 的体积．

1．4．3．3 饱和吸附量的确定 将一定量大孔树脂装柱，以0．61 mg/mL 黄酮液上柱，流速1．5 mL/min，收集流出液，测定流出液体积及吸光度．直至流出液吸光度与黄酮原溶液吸光度一样时，即达到饱和吸附量，停止上柱．

1．4．3．4 洗脱剂质量体积分数的确定 先用蒸馏水洗脱，洗去大孔树脂吸附的多糖(取1 mL 蒸馏水洗脱液按苯酚－硫酸法检测多糖，至颜色变为无色时停止蒸馏水洗脱)，而后依次用50 mL 30%、50%、70%、90%乙醇溶液洗脱，收集不同质量体积分数乙醇洗脱液，测定黄酮质量体积分数，以确定最佳洗脱剂．

1．4．3．5 黄酮纯溶液的收集 在层析柱中加入一定量树脂，加入一定量(能使树脂达到饱和吸附状态)提取液，只至达到饱和吸附，先用蒸馏水洗脱多糖类物质，接着用乙醇洗脱，并收集前30 管，每管5 mL，流速为1．5 mL/min．收集后，分别取0．5 mL 收集液测其吸光值．

1．4．4 不同产地火棘果黄酮提取液及黄酮纯化后的抗氧化作用研究

1．4．4．1 对DPPH 自由基的清除作用 在试管中依次加入2．5 mL 6．5×10－5mol/L DPPH 和1．5 mL 60%乙醇，总体积4．0 mL，混合20 min 后，于1 cm 比色皿测定517 nm 吸光度记为A0;加入2．5 mL 6．5×10－5mol/L DPPH 再加入各梯度提取液，即5、10、15、20、25 μg/mL 黄酮提取液，最后加入60%乙醇至4．0 mL 测定A517nm记为Ai;加入2．5 mL60%乙醇和各梯度待测液，各加60%乙醇至4．0 mL，测定A517nm记为Aj;按下列公式计算DPPH自由基清除率［10］．

1．4．4．2 对超氧自由基清除率的测定 采用邻苯三酚自氧化法测定，取4．5 mL pH 8．23 50 mmol/L Tris－HCl 缓冲液、4．2 mL 蒸馏水，混匀后室温保持20 min，取出后立即加入3 mmol/L 邻苯三酚(以10 mmol/L HCl配制，空白管用10 mmol/L HCl 代替邻苯三酚溶液)0．3 mL，迅速摇匀后，在325 nm 下每隔30 s 测定吸光度．加入邻苯三酚前，先加入一定体积黄酮溶液，蒸馏水减少，再按下述方法计算抑制率［11］．抑制率计算公式:

式中:△A0为邻苯三酚的自氧化速率，△A为加入黄酮溶液后邻苯三酚的自氧化速率，单位均匀为吸光度每分钟的增值．

2 结果与分析

2．1 不同产地火棘果中黄酮含量测定结果

分别对6 种原料的火棘果实中的黄酮含量进行测定，重复3 次，具体结果见图1．

图1 不同产地火棘果黄酮含量Fig．1 The flavonoide quantity of different kinds of Pyracantha fortuneana fruits

由图1 可以看出，不同产地火棘果黄酮含量差异显著，尤其是C3 黄酮含量最高，其次是C2，这可能是由于成熟期对黄酮含量有影响．

2．2 火棘果黄酮的分离纯化

2．2．1 大孔树脂的筛选 试验选择黄酮含量最高的宣恩晓关的火棘果为原料研究其纯化工艺，具体结果见表2．大孔树脂由于其理化性质不同对黄酮的吸附及解吸影响很大，树脂的极性、孔径、比表面积、孔容等均能影响其吸附率．从表2 可以看出，AB－8 对黄酮的吸附能力相对较强，解析率也相对较高，相同条件下AB－8 型大孔树脂解吸出来的黄酮量较多，故选择AB－8 型大孔树脂为分离纯化火棘果黄酮树脂．

表2 3 种大孔树脂对火棘果黄酮吸附及解吸性能比较Tab．2 Comparison of adsorption and desorption of three types macroporous resin on Pyracantha fortuneana fruit flavonoid

2．2．2 饱和吸附量确定 按照试验方法1．4．3．3 进行树脂饱和吸附量的确定，以黄酮溶液的上样体积为横坐标，流出液的吸光度值为横坐标绘制饱和吸附量曲线，具体结果见图2．

图2 AB－8 型大孔树脂对黄酮的动态吸附能力Fig．2 Dynamic adsorption capability of AB－8 macroporous resins on flavonoid

由图2 可知，AB－8 型大孔树脂对黄酮的吸附达到饱和时的上样体积约为80 mL，即树脂吸附的黄酮总量为16．161 mg，吸附量为0．946 mg 黄酮/mL 树脂．

2．2．3 洗脱剂质量体积分数的优化 火棘果黄酮溶液中含有水溶性杂质如可溶性糖，因此上样后先用水洗脱以除去极性较大的糖类物质，而后按照实验方法分别选用30%、50%、70%、90%的乙醇进行洗脱，测定结果见表3． 由表3 可知当洗脱剂质量体积分数为30%时洗脱率最大，可收集到最多纯液，故选用此质量体积分数乙醇溶液作为洗脱剂．

表3 不同质量体积分数乙醇对黄酮的洗脱效果Tab．3 The eluted effect on flavonoides of different concentration ethanol

2．2．4 黄酮纯化溶液的收集 首先上样使AB－8 树脂对火棘果黄酮达到饱和吸附，而后用蒸馏水洗脱至无糖为止，接着用30%的乙醇进行洗脱，并按每管5 mL 收集洗脱液，以收集管数为横坐标，洗脱液黄酮的吸光度为纵坐标绘制洗脱曲线，结果见图3．由图3 可以看出洗脱液共有一个洗脱峰，且6～16 管黄酮含量达到最高值，因此重复上样，重复收集6～16 管，以制备纯化黄酮．

图3 AB－8 型大孔树柱层析结果Fig．3 The column chromatography map of AB－8 type resin

2．3 火棘果黄酮提取液及纯化后的抗氧化研究

2．3．1 对DPPH 自由基清除率的测定 分别测定收集制备的C3 火棘果黄酮与其他6 种未纯化的火棘果黄酮对DPPH 自由基的清除作用，结果见表4．

半数清除质量体积分数(IC50)被普遍采用作为评价抗氧化剂清除自由基能力强弱的指标．半数清除质量体积分数即体系平衡后，自由基被半数消除时所需要加入抗氧化剂的质量体积分数． 从表4 的IC50值可以看出，火棘果黄酮对DPPH 自由基具有很强的清除能力，尤其是C1、C4、C5、C6 显著高于C2、C3 和纯化后的C3，由此可见成熟度对火棘果黄酮抗氧化作用影响很大;此外纯化后的火棘果黄酮对DPPH 自由基的清除能力强于未纯化的，这可能是由于纯化降低了火棘果黄酮中杂质的干扰．

表4 火棘果黄酮及纯化后火棘果黄酮对DPPH 自由基清除作用Tab．4 The inhibition effect on DPPH of flavonoide of Pyracantha fortuneana fruit and the purified

2．3．2 对超氧自由基清除率的测定 利用邻苯三酚自氧化体系，研究收集制备的C3 火棘果黄酮与其他6 种未纯化的火棘果黄酮对超氧阴离子自由基的清除作用，结果见表5．

表5 火棘果黄酮及纯化后黄酮对超氧自由基清除作用Tab．5 The inhibition effect on ultra oxygen free radical of flavonoide from Pyracantha fortuneana fruit and the purified

超氧自由基是机体代谢过程中产生的，在清除超氧自由基实验中，火棘果黄酮表现出良好的清除能力，并且清除效果与黄酮质量体积分数具有良好的量效关系．从表5 的IC50值可看出，实验的6 个产地的火棘果黄酮对超氧自由基的抗氧化能力相差不大，同时纯化后的火棘果黄酮对超氧自由基的清除能力与纯化前的效果相当．

3 结论

通过以上试验可以得出，成熟度较低的火棘果中黄酮的含量较高． 对3 种大孔树脂的动态吸附和解吸效果进行了比较，得出AB－8 型大孔树脂吸附率和解吸率都高一些，选择性好，适于火棘果黄酮的分离纯化．

在DPPH 体系和邻苯三酚自氧化体系中，火棘果黄酮对DPPH 自由基和超氧自由基有显著的清除效果，且随着黄酮质量体积分数升高，清除率也随之升高．经纯化后的火棘果黄酮较纯化前的火棘果黄酮抗氧化性有所增强．但是不同产地的火棘果黄酮对两种自由基的清除能力不同，尤其是对DPPH 自由基的清除能力差异较大，这可能与其中所含的黄酮种类有关，此部分内容有待于进一步深入研究．

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