亚细亚酸对兔未成熟肺缺血再灌注损伤的保护作用

闫宪刚 仇万山 贾 兵

·论著·

亚细亚酸对兔未成熟肺缺血再灌注损伤的保护作用

闫宪刚 仇万山 贾 兵

目的 观察亚细亚酸对兔未成熟肺缺血再灌注损伤的保护作用。方法 选用15 ～ 21日龄新西兰白兔60只，分为5组：假手术组，对照组，亚细亚酸低、中和高剂量组，每组各12只。建立单肺缺血再灌注模型，肺门阻断1 h后，开放再灌注4 h。亚细亚酸低、中和高剂量组分别于术前3 d给予亚细亚酸7.5、15和30 mg·kg-1,假手术组仅开胸不阻断肺门，对照组不予干预。术毕收集肺组织，光镜和电镜观察肺组织病理和超微结构改变。测定肺组织丙二醛(MDA)，细胞毒性活性氧(ROS)-HR、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)水平。Western Blot检测髓样生化因子(MyD)88和核转录因子(NF-κB)水平。ELISA法检测IL-1β、TNF-α水平。结果 ①亚细亚酸中和高剂量组肺缺血再灌注损伤明显减轻，光镜下肺泡与肺泡间隔肿胀程度明显轻于对照组，肺泡腔渗液减少，出血少见。电镜下可见肺泡上皮与血管内皮细胞脱落明显减少。②亚细亚酸中和高剂量组较对照组肺组织MDA，ROS-HR水平明显降低，SOD及GSH-PX水平明显升高；各时点的IL-1β、TNF-α水平也有不同程度下降，特别是再灌注后的2 h和4 h(P<0.05)；肺组织中MyD88和NF-κB表达显著下降。③亚细亚酸中和高剂量的保护效果较好。结论 亚细亚酸对未成熟肺缺血再灌注损伤有一定的保护作用，其机制与清除氧自由基和减轻全身炎性反应有关。

幼兔； 缺血再灌注; 肺损伤； 亚细亚酸

随着外科技术和围术期监护技术的提高，先天性心脏病(CHD)的手术趋于低龄化，但体外循环心内直视手术后肺缺血再灌注损伤，仍是临床常见的并发症，急性肺损伤的发生率为15%～30%[1]，重症病死率达15% ～ 50%[2]。特别对于新生儿和婴幼儿CHD术后未成熟肺缺血再灌注损伤的发生率更高，程度更严重，是影响预后的最常见因素[3，4]，因此肺保护一直是心脏外科领域的研究热点之一。亚细亚酸(asiatic acid)是积雪草提取物中的五环三菇烯类组分，具有抗炎和抗损伤作用[5]。国外学者已证实亚细亚酸对脑局灶性缺血再灌注损伤有一定保护作用[6]，尚未见对未成熟肺保护作用的报道。故本研究建立幼兔肺缺血再灌注模型，观察亚细亚酸是否可以减轻肺缺血再灌注损伤，探讨一种新的针对未成熟肺的保护方法，为改善婴幼儿CHD外科预后提供理论上的依据。

1 方法

1.1 实验动物 相同遗传背景的15～21日龄新西兰兔60只(体重0.6～0.8 kg)，上海农业科学院畜牧兽医研究所提供，提前1周送至本研究动物实验房喂养，以适应环境(温度22℃，湿度60%)。

1.2 分组和干预 分为5组：假手术组，对照组，亚细亚酸低、中和高剂量组，每组各12只。参照Skauma等[7]方法建立单肺缺血再灌注损伤模型：禁食12 h，戊巴比妥钠15 mg·kg-1静脉麻醉，左侧卧位，经右前外侧切口，第5肋间进胸，显露右侧肺门，分离动脉、静脉及支气管。静脉注射肝素200 U·kg-1，5 min后用18号小弯无损伤钳，阻断右肺门1 h后再开放。假手术组仅开胸，不阻断肺门。亚细亚酸低、中和高剂量组分别于建模前3 d喂服亚细亚酸(纯度95%，批号84696-21-9，广西昌洲天然产物开发有限公司)7.5、15和30 mg·kg-1，对照组不给予干预。

1.3 观察指标

1.3.1 炎性因子水平 各组于开放肺门(再灌注)前、开放(再灌注)后1、2和4 h采集血样，ELISA法检测各时点IL-1β和TNF-α水平，试剂盒由上海希美生物科技有限公司提供。

1.3.2 丙二醛(MDA)、细胞毒性活性氧(ROS)-HR、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)水平测定 各组于术毕收集右下肺叶，称取肺组织200 mg，按重量体积比加入9倍的生理盐水制成10%的组织匀浆，2500 r·min-1离心10 min，取上清液再用生理盐水稀释成0.1%的匀浆，ELISA法测定MDA、ROS、DOS和GSH-PX水平，试剂盒由南京建成生物研究所提供。

1.3.3 髓样分化因子(MyD)88和核转录因子(NF-κB)水平测定 各组于术毕收集右下肺叶，采用全细胞蛋白抽提试剂盒提取肺组织细胞内蛋白。取50 μg 蛋白，95℃变性 5 min，以Western-blot法进行蛋白电泳，分别加入兔抗鼠 MyD88和NF-κB、Lamin B、β-actin一抗，4℃过夜；洗膜3次，加入 HRP 标记二抗，37℃孵育1 h，洗膜 3 次；用 Odyssey红外荧光扫描机成像系统进行扫膜。采用Bandscan 5. 0软件对蛋白条带进行灰度值分析，以目的条带与β-actin、Lamin B内参照条带的比值代表蛋白的表达水平。每一个条带代表3次重复实验的结果。

1.3.4 血流动力学指标和血气指标 各组于缺血再灌注后2 h时点采集血样，行血气分析和血流动力学指标分析。

1.3.5 肺组织病理和超微结构改变 各组取右肺下叶组织2块，1块以10%甲醛室温下固定18 h，乙醇梯度脱水，石蜡包埋，制成厚4 μm的切片，苏木精-伊红染色，光镜观察；另一块组织快速固定于2.5%的冷戊二醛液2 h，1%锇酸再固定1 h，丙酮梯度脱水，Epon-812树脂包埋，半薄切片定位与肺泡结构，70 nm超薄切片，醋酸铀-柠檬酸铅双重电子染色，JEM-1200透射电镜观察。

2 结果

2.1 死亡率 假手术组、对照组、亚细亚酸低、中和高剂量组分别有1、6、4、3和4只兔死亡。

2.2 各组肺组织MDA，ROS-HR水平比较 表1显示，对照组ROS-HR和MDA水平显著高于假手术组(P<0.05)，亚细亚酸中、高剂量组ROS-HR和MDA水平显著低于对照组(P<0.05)；亚细亚酸低剂量组ROS-HR和MDA水平与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。亚细亚酸三个剂量组中，中剂量组ROS-HR和MDA水平最低。

2.3 各组肺组织SOD、GSH-PX水平比较 如表1所示，对照组肺组织线粒体SOD和GSH-PX水平显著低于假手术组(P<0.05)，亚细亚酸中剂量组SOD水平和GSH-PX活性显著高于对照组(P<0.05)，亚细亚酸低、高剂量组SOD水平和GSH-PX活性与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4 各组肺组织MyD88和NF-κB表达水平比较 图1和表1显示，对照组肺组织线粒体MyD88和NF-κB水平显著高于假手术组(P<0.05)，亚细亚酸低、中、高剂量组MyD88和NF-κB水平显著低于对照组(P均<0.05)。

2.5 各组血浆TNF-α和IL-1β水平比较 图2显示，对照组再灌注前、再灌注后1、2、4 h TNF-α和IL-1β水平均显著高于假手术组(P<0.05)，于再灌注后2 h达峰值，之后略有下降。再灌注前：亚细亚酸低、中和高剂量组IL-1β水平显著低于对照组，亚细亚酸中、高剂量组TNF-α水平显著低于对照组(P<0.05)；再灌注后1 、2和4 h：亚细亚酸低、中和高剂量组IL-1β和TNF-α水平显著低于对照组(P<0.05)。

图1 MyD88和NF-κB电泳条带

Fig 1 Electrophoresis strip of MyD8 and NF-κB in different groups

Notes 1: Sham group; 2 I/R group; 3 asiatic acid low dose group; 4 asiatic acid medium dose group; 5 asiatic acid high dose group

表1 各组MDA，ROS-HR、SOD、GSH-PX、MyD88和NF-κB水平比较

Notes 1)vssham group,P<0.05; 2)vsI/R group,P<0.05

2.6 各组再灌注2 h血流动力学和血气指标比较 表2显示，各组在体温、肺局部温度、Hb水平和血液pH值指标上差异均无统计学意义(P均>0.05)。缺血再灌注2 h时点对照组与假手术组比较，血液动力学指标心率显著减慢、动脉收缩压、动脉舒张压和平均压显著下降(P均<0.05)；外周血WBC显著增高(P<0.05)；血气指标PO2显著下降，PCO2显著升高(P<0.05)。

图2 各组灌注前和灌注后不同时点TNF-α和IL-1β水平比较

Fig 2 Comparison of TNF-α IL-1βlevels before and after reperfusion at different time points in different groups

Notes Before reperfusion, the TNF-α IL-1βlevels of I/R group were siginificant higher than sham group(P<0.05). 1, 2 and 4 h after reperfusion, TNF-α and IL-1βlevel of asiatic acid low, middle and high dose group were siginificant lower than sham group(P<0.05)

亚细亚酸低、中、高剂量组与对照组相比，血流动力学指标心率显著加快、动脉收缩压、动脉舒张压和平均压显著上升(P<0.05)；外周血WBC计数显著降低(P<0.05)；血气指标PO2显著升高，PCO2显著下降(P<0.05)，上述指标不同剂量亚细亚酸组间无显著差异(P>0.05)，与假手术组差异也无统计学意义(P>0.05)。

2.7 各组肺组织病理学改变 假手术组光镜下可见肺泡清晰，结构完整，无塌陷，无肿胀或渗液(图3A)；对照组可见肺组织微血栓阻塞毛细血管，较多白细胞侵润，肺泡细胞与间隔组织肿胀明显，肺泡腔内有较多渗液，部分肺泡腔塌陷(图3B)；亚细亚酸低剂量组肺组织损伤较对照组略有改善，可见白细胞侵润，肺泡和间隔组织肿胀明显，肺泡腔内较多渗液，间质炎细胞多见(图3C)；亚细亚酸中、高剂量组肺组织损伤明显好转，可见肺泡细胞与间隔组织轻微肿胀，肺泡腔内渗液消失，少见微血栓阻塞毛细血管，无明显白细胞侵润，少部分肺泡腔略塌陷(图3D,E)。

假手术组电镜下可见肺泡壁结构完整，上皮细胞及其游离面有少量的微绒毛清晰，基底膜完整，细胞核较大，居中，线粒体圆或椭圆，核糖体丰富，粗面内质网短杆状，细胞质内有大量的板层小体(图4A)；对照组可见上皮细胞肿胀，线粒体肿胀电子密度降低、局灶性空化变性，嵴消失、破裂，基底膜菲薄，吞饮小泡增多，表面微绒毛形成指状突起，基底膜水肿、增厚(图4B)；亚细亚酸低剂量组肺组织电镜结构较对照组略有改善，细胞结构模糊、排列尚规整，吞饮小泡存在，仍有空化变性，基底膜水肿、增厚(图4C)；亚细亚酸中、高剂量组可见肺泡结构存在，细胞器略减少，但结构相对正常，线粒体无明显肿胀，无明显空化变性，无空化变性，嵴存在，间质血管略充血，可见间质炎细胞，间质纤维结构上清晰、排列尚规整(图4D,E)。

表2 各组再灌注2 h时点血液动力学和血气指标比较

Notes 1)vssham group,P<0.05; 2)vsI/R group,P<0.05

图3 各组肺组织光镜下所见(HE staining, ×100)

Fig 3 Findings under light microscope of lung tissue in 5 groups(HE staining, ×100)

Notes A: sham group showed the normal lung structure; B: I/R group showed remarkable alveolar and interstitial edema, alveolar space collapse, infiltrated inflammatory cells, and detached epithelial cells; C: asiatic acid low dose group showed slightly decreased alveolar and interstitial edema; D,E: asiatic acid middle and high dose group showed obviously decreased alveolar and interstitial edema, alveolar space collapse and detached epithelial cells

图4 各组肺组织电镜下所见(×10 000)

Fig 4 Findings under transmission electron microscope of lung tissue in 5 groups(×10 000)

Notes A: sham group showed the normal lung structure; B: I/R group showed swollen, vacuolated and near-broken mitochondria; C: asiatic acid low dose group showed slightly improvement of mitochondria; D,E: nearly normal appearance of mitochondria

3 讨论

目前认为肺缺血再灌注损伤和全身炎症反应是体外循环相关性肺损伤最主要的发生机制[8]。在肺动脉恢复灌注后，大量氧和血进入肺脏，产生大量氧自由基、炎症因子和细胞酶类，导致肺血管内皮细胞广泛受损，通透性增加，导致肺缺血/再灌注损伤。晚近有研究报道，婴幼儿器官组织抗氧化能力较低，更易受到氧化应激的侵害[7,9～11]。本研究前期证实了未成熟兔肺更容易发生缺血再灌注损伤，且损伤程度和时间均较成熟兔更为严重[11]。

ROS和MDA是反映组织的损伤指标，MDA体现机体细胞氧化损伤的程度。缺血再灌注可导致SOD水平和活性下降，ROS过度释放，MDA水平增高，血循环TNF-α、IL-1β水平升高[13]，线粒体功能下降，组织细胞死亡。本研究显示15～21日龄兔建立的缺血再灌注模型可观察到上述指标的变化，提示建模成功。

亚细亚酸具有抗炎、抗氧化、保护线粒体及抗细胞凋亡等作用[14～16]。Gao等[17]研究显示，亚细亚酸可清除超氧负离子和羟基，剂量依赖性抑制钙离子诱导的线粒体溶胀，保护肝线粒体。Tabassum等[6]研究显示，亚细亚酸可改善缺血再灌注后大鼠的异常行为，缩小脑梗死范围，增高组织SOD和GSH-PX水平。Huang等[18]研究角叉菜胶诱发大鼠足趾炎性痛模型显示，亚细亚酸可增高SOD和GSH-PX活性，降低NF-κB的表达。本研究显示，给予亚细亚酸干预后，幼兔肺组织SOD、GSH-PX升高，ROS下降，其中以中、高剂量组效果为著；同时缺血再灌注后2、4 h时点血浆TNF-α和IL-1β水平显著降低；提示一方面亚细亚酸可能通过提高肺组织的抗氧化能力和降低氧自由基的产生，另一方面通过降低机体炎症反应，改善了缺血再灌注后的肺损伤。同时亚细亚酸干预组的MyD88和NF-κB表达也显著下降，提示炎症反应的降低可能与其传导通路上MyD88和NF-κB表达下调有关。亚细亚酸对缺血再灌注肺损伤的保护作用还体现在血流动力学和血气指标的改善，动物存活率的提高。

进一步观察各组肺组织的病理学变化，显示与上述氧化应激指标变化较为一致的变化，对照组可见较为严重的损害，亚细亚酸低剂量组肺组织损伤略有改善，而亚细亚酸中、高剂量组可见肺组织的明显改善。Gao等[19]观察亚细亚酸不同剂量(25、50、100 mg·kg-1)对成熟小鼠肝损伤均有保护作用，3种剂量均可抑制线粒体钙内流，阻止线粒体膜电位的下降，减轻线粒体肿胀。从本研究3种干预剂量来看，低剂量组氧化应激和炎症指标改善不明显，而中和高剂量可明显改善氧化应激损伤，但亚细亚酸对缺血再灌注肺损伤的量效关系仍需进一步研究。

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Asiatic acid attenuates ischemia-reperfusion induced lung injury in infant rabbits

YANXian-gang,QIUWan-shan,JIABing

(Children′sHospitalofFudanUniversity,DepartmentofCardiovascularSurgery,Shanghai201102,China)

JIA Bin, E-mail:jiabing2012@hotmail.com

ObjectiveThe aim of the study was to examine whether asiatic acid could attenuate ischemia-reperfusion(I/R) induced lung injury in infant rabbits.Methods60 New Zealand white rabbits aged from 15 to 21 days were subjected to sham operation, I/R, low dose asiatic acid plus I/R, medium dose asiatic acid puls IR, and high dose asiatic acid puls I/R. I/R was induced by clamping the right pulmonary hilum for 1 hour and then removal of the clamp for 4 hours. Asiatic acid was given 3 days before operation by 7.5mg, 15, 30 mg·kg-1respectively. Production and expression of free radical species-hydroxyl radical (ROS-HR), malondialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-PX), myeloid differentiation factor-88(MyD-88), and muclear factors-κB(NF-κB) in the lung tissue were also evaluated. And temperature, hemodynamics, blood gases and neutrophil count were measured 2 hours after reperfusing. In addition, serum levels of interleukin-1β and tumor necrosis factor-α were measured during the ischemia-reperfusion process.ResultsThe infant lungs in asiatic acid middle and high dose groups had less neutrophil infiltration, edema, swelled alveolar epithelial and endothelial cells under light and electron microscopes. ②Compared wtih I/R group, asiatic acid reduced the production of ROS-HR and MDA and improved the activities of GSH-PX and SOD markedly, siginificantly decreased the serum levels of interleukin- 1β and tumor necrosis factor-α at 4 h time point after reperfusion, as well as the MyD88 and NF-κB of lung were siginificantly decreased(P<0.05).③Asiatic acid middle and high dose groups had good effect of attenuating I/R.ConclusionsAsiatic acid pretreatment reduced the lung damage induced by I/R in the infant rabbits

Infant rabbit; Ischemia-reperfusion; Lung injury; Asiatic acid

江苏省自然科学基金：BK2009452

复旦大学附属儿科医院心血管中心 上海，201102

贾兵，E-mail:jiabing2012@hotmail.com

10.3969/j.issn.1673-5501.2013.02.014

2013-03-12

2013-04-01)

丁俊杰)