千层塔中产石杉碱甲内生真菌的研究

董丽辉，范三微，凌庆枝*，钱海峰，魏兆军

1浙江医药高等专科学校，宁波 315100;2 合肥工业大学生物与食品工程学院，合肥 230009

石杉碱甲(Huperzine A)分离自我国传统中药千层塔，其商品名为哈伯因，化学名为(5R，9R，11E)5-氨基-11-亚乙基-5，6，9，10-四氢-7-甲基-5，9-亚甲环芳辛并-2(1H)吡啶酮。药理学研究表明石杉碱甲是一种高选择性抑制乙酰胆碱酯酶(AChE)的药物，能够改善多种认知功能缺陷，治疗重症肌无力和早中期老性痴呆症(Alzheimer's disease，简称AD)具有显著疗效。目前国际上已将石杉碱甲列为第二代乙酰胆碱酯酶抑制剂之一，1995 年石杉碱甲制剂在国内上市应用［1］。随着老龄化社会的到来，对治疗老年痴呆症的药物的需求量会越来越大，石杉碱甲仅依靠千层塔植物的提取远不能满足社会的需求，石杉碱甲来源问题已成为国内外研究的热点。

内生菌是指那些在其生活史中的某一阶段生活在植物组织内，对植物组织没有引起明显病害症状的菌。研究证实，生活在植物体的内生真菌与宿主植物具有相同的次生代谢产物的合成途径，能产生与宿主相同或相似的，具有生理活性的代谢产物。自1993 年发现从短叶红豆杉中分离出的内生真菌能够合成抗癌成分紫杉醇以来［2］，人们希望通过寻找合适的内生真菌并使其发酵合成药用成分，内生真菌有可能成为开发新型药效活性物质的重要生物资源。前期的研究证实，千层塔植物中蕴含大量的内生真菌，这给筛选产石杉碱甲内生真菌提供了天然的资源。

本试验从千层塔中分离到了不少有价值的内生真菌，在此基础上对内生真菌的发酵产物进行乙酰胆碱酯酶抑制和清除DPPH·自由基能力的试验，对内生真菌发酵提取物进行TLC 和HPLC 检测，以便进一步筛选产石杉碱甲的菌株。

1 材料与方法

1.1 植物材料

供试材料千层塔Huperzia serrata (Thunb.)Trev.采自浙江杭州天目山脉。

1.2 仪器与试剂

TLC 板(GF254):烟台江友硅胶开发有限公司;DIONEX-3000 高效液相色谱仪;电泳仪及电泳槽:美国Bio-Rad 公司;PCR 反应扩增仪:加拿大BBI 公司;3730 测序列分析仪:美国ABI 公司;多功能酶标仪:美国热电公司。

乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase，AChE)、二苯代苦味酰基DPPH 标准品，均购自Sigma 石杉碱甲(Huperzine A，HupA)标品:中国食品药品检定研究院提供;色谱纯甲醇:天津市四友精细化学品有限公司;引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCC-TCCGCTTATTGATATGC-3'):由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。醋酸铵及其他试剂均为国产分析纯或生物试剂。

1.3 方法

1.3.1 千层塔内生真菌的分离及发酵产物制备

选用新鲜药用植物千层塔，洗净后，流水冲洗4 h。在超净工作台上 按茎、叶、根分开。茎用0.1%升汞溶液消毒15 min。叶片和根在0.1%升汞溶液中浸泡10 min。取出材料，无菌水冲洗6 遍。在无菌条件下，将根茎叶分别切成0.5 cm 的长度接种于MS 培养基上。28 ℃培养40 d，将最后一次荡洗的水涂布在平板上作对照。培养7 d 以后，对照板上并没有菌生长，而千层塔的切口处有菌丝长出，用接种环将菌丝接种到新的PDA 培养基上，平板划线分离，得到纯的菌株。

采用马铃薯液体培养基培养内生真菌，28 ℃，120 rpm，培养10 d，收集菌丝，破碎细胞，用热乙醇回流提取有效成分，浓缩提取液到1 mL。发酵液浓缩后用乙醇醇沉，除多糖，蛋白，浓缩到1 mL。保存于4 ℃冰箱备用。

1.3.2 内生真菌发酵产物AChE 抑制活性检测

方法参照［3］的方法，在试管中加入内生真菌的菌丝或发酵液提物样品20 μL、在15 μL 0.22 U/mL AChE、15 μL 15 mmol/L ATCI，加磷酸缓冲液50 μL，摇匀37 ℃恒温30 min，加10 μL 4%十二烷基硫酸钠，室温下终止反应20 min，移入96 孔板上，加显色剂125 μL 3 mmol/L，DTNB 显色5 min，412 nm处酶标仪检测，设为A样品，每个样品都设一个不加底物，反应条件和样品一样，测得值设为A本底，阴性对照用磷酸缓冲液代替样品，反应条件与样品一致，测定值设为A阴性，阳性对照不加底物，其它条件与阴性对照一致，测定值设为A阳性，以下列公式计算内生真菌对AChE 的抑制率(I):

1.3.3 内生真菌发酵提取物清除DPPH·自由基能力的测定［4］

取发酵液或菌丝体提取物样品1 mL，加入2.4 mL 0.2 mmol/L DPPH 溶液，混匀，加水0.6 mL，室温静置暗反应30 min，测定517 nm 处的吸光度为A1。对照品用样品溶剂替代，测得的吸光度为A2，未反应时DPPH 的值吸光度为A0。

1.3.4 TLC 检测发酵产物

用2 cm×10 cm 的硅胶板，展开剂为:氯仿/丙酮/异丙醇(4∶6∶4)，显色剂:0.3%高锰酸钾溶液，用毛细管直接将0.4 μL 样品和石杉碱甲标准品点在距薄层板一端约1 cm 处，点完干燥后将板置于展开液中，待展开到离板另一端约1 cm 处取出层析板，自然干燥。待溶剂基本挥发后，用喷雾器喷上显色剂，吹干，记录斑点，测Rf值。

1.3.5 HPLC 检测发酵产物

采用DIONEX-3000 色谱系统，ODS-C18反相柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，色谱条件为:流动相为甲醇:0.1 moL/L 醋酸铵(pH 6.0)(36∶64);流速1 mL/min，进样量20 μL，柱温25 ℃，检测波长308 nm。称取石杉碱甲标准品12.75 mg，于25 mL 的容量瓶中用流动相溶解置刻度。吸取石杉碱甲标准品溶液0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mL 置于10 mL 容量瓶中稀释到刻度，样品用流动相稀释成5 mL 的溶液，膜过滤备用，根据石杉碱甲标准品色谱峰的保留时间对样品定性，以峰面积与对应浓度绘标准曲线，并计算样品中石杉碱甲的含量。

1.3.6 产石杉碱甲菌株的形态学鉴定

将内生真菌菌株接种于PDA 或查氏培养基上，对真菌菌落的形态特征进行观察，将灭菌的滤纸于无菌水中湿润，置于培养皿中，放上灭菌载玻片上，在载玻片上滴上一滴PDA 培养基，将真菌接种到培养基上，盖上盖玻片培养，培养后对菌株的菌丝、孢子囊等微观形态进行观察记录。最后，比照《真菌鉴定手册》［5］，鉴定所分离的内生真菌的种属。

1.3.7 菌株的分子鉴定

将培养在PDA 上的内生真菌菌丝刮下，置于试管中，加500 μL CTAB 提取缓冲液，玻棒研磨，65 ℃保温1 h，12000 rpm 离心10 min，取上清，饱和酚和氯仿异戊醇分别抽提后，用无水乙醇沉淀，12000 rpm 离心，倒出乙醇溶液，沉淀晾干后，溶于50 μL纯水中备用。

PCR 扩增菌株ITS 区段:根据已知真菌的保守序列设计特异性引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCC-TCCGCTTATTGATATGC-3')，以真菌基因组DNA 为模板，扩增菌株ITS区段。PCR 反应体系为:PCR 体系建立(25 μL):TempLate(基因组)1 μL，引物各(10 μmoL/L)0.5 μL，dNTP(各10 mmoL/L)0.5 μL，10 ×PCR Buffer 2.5 μL，Taq(5 U/μL)0.2 μL 加水至25 μL。反应条件:预变性94 ℃5 min;循环94 ℃30 s，55 ℃35 s，72 ℃1 min，35 个循环，延伸8 min。PCR 产物用1%凝胶电泳进行检测，送交上海生工生物工程技术服务有限公司测序，序列提交到GenBank 核酸序列数据库并得到登录号。应用Blast 程序对所测得的内生真菌ITS 序列进行相似性比对。采用软件ClustaLX 1.81 进行多序列的比较，比对结果采用DNAStar MegAlign 软件进行系统进化树的构建。

2 结果与分析

2.1 千层塔内生真菌的分离

从千层塔植物中分离到94 株内生真菌，对照培养基上并无菌生长，可以确定分离到的94 株为内生真菌，结果如表1 所示其中茎中所含内生真菌最多，为49 株，占总菌株数的52.12%;其次为叶片38株，占40.42%，根内最少，仅7 株，占7.44%。将内生真菌通过形态观察分类可以将菌株归到Penicillium、Cladosporium、Colletotrichum、Acremonium、Mortierella、Paraconiothyrium、Leptosphaeria、Shiraia、Arthrinium、Podospora 等12 个属，其中Penicillium、Colletotrichum、Podospora 为优势类群。

表1 千层塔不同组织中分离到的内生菌Table 1 Isolation of endophytic fungi from different parts of H.serrate

2.2 内生真菌发酵提取物抑制乙酰胆碱酯酶和清除DPPH·自由基能力检测结果

将内生真菌发酵菌丝和发酵液提取物分别做抑制乙酰胆碱酯酶活性检测和清除DPPH·自由基能力检测，结果见表1。菌S29、S94、L44 这三株内生真菌有明显活性。从表1 可见，菌丝体提取物对乙酰胆碱酯酶的抑制活性比发酵液提取物对乙酰胆碱酯酶的抑制活性高，而菌丝体提取物和发酵液提取物对DPPH 自由基的清除率比较接近。

表2 内生真菌发酵提取物对乙酰胆碱酯酶抑制率和DPPH·自由基清除率Table 2 DPPH· scavenging and AchE inhibitory activities of mycelium and fermentation broth of endophytic fungi

2.3 内生真菌发酵提取物TLC 检测结果

将内生真菌的菌丝提取物和发酵液提取物和石杉碱甲标准品点样层析，结果(图1)显示，S29 菌丝提取物中有石杉碱甲或其类似物，迁移率与石杉碱甲标准品接近，石杉碱甲和S29 菌丝提取物的迁移率分别为0.707、0.699，其他内生真菌发酵产物并未发现有迁移率与石杉碱甲标准品非常接近。

图1 千层塔内生真菌S29(A)及石杉碱甲(B)的TLC 色谱图Fig.1 TLC analysis results of HupA standard (A)and endophytic fungus S29 from H.serrate (B)

2.4 菌株S29 发酵提取物HPLC 测定结果

石杉碱甲标准品经过高效液相色谱检测，不同浓度标准品都在保留时间5.97 min 有强的吸收峰(图2A，C标准品=51 μg/mL，峰面积=27.152)不同浓度的标准品的峰面积与对应浓度绘制的标准曲线得回归方程为:y=0.531x +0.2637，r2=0.9996，石杉碱甲在5.1～51 μg/mL 有良好的线性关系。菌株S29 的菌丝体提取物在保留时间5.940 min，有相似的吸收峰(图2B，峰面积=6.168)并与其他杂质成良好的分离，S29 的发酵液体取物种并没有类似的吸收峰，故推测S29 是产石杉碱甲的内生真菌，并且石杉碱甲在菌丝体中，应为胞内产物。根据标准曲线的回归方程，计算出S29 样品中石杉碱甲含量为11.12 μg/mL，共为5 mL，样品中石杉碱甲量为55.60 μg，菌丝体的重量为1.098 g，故每克干菌体的石杉碱甲的含量50.64 μg。

图2 石杉碱甲(A)及内生真菌S29 菌丝体(B)的HPLC 色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of HupA stardand (A)and strain S29 (B)

2.5 产石杉碱甲菌株S29 鉴定

产石杉碱甲菌株S29 接种于PDA 培养基中间28 ℃，培养6 d 菌落直径为50 mm，培养到13～14 d可以铺满整个培养皿，菌落在生长4～6 d 颜色为黑色，略显棕色，边缘一圈为淡黄色，生长至整个平皿时边缘为黑色，菌落中间为棕色，质地为绒状，菌落中间有细小的颗粒状，在PDA 培养基上反面为黑色，菌落边缘一圈略先淡黄色，在查氏培养基上，培养4～5 d，菌落的直径为45～50 mm，10 d 可以铺满整个平皿，在麦麸培养基上菌落易扩展，气生菌丝较松散，橄榄绿色，无可溶性色素;在显微镜下观察，菌丝有横隔，显微特征:玉米粉培养基上培养15 d，可见子囊果生长。菌丝发达，有隔，褐色，子囊果发育在菌丝层上，为球形无孔闭囊壳，单独、表生，球形，直径130～220 μm，无孔口;厚壁，棕褐色，子囊棍棒状;子囊孢子深褐色，园形，厚壁，无芽孔(图3)。

图3 菌株S29 菌落及显微特征Fig.3 Colony and microscopic characteristics of strain S29

2.6 菌株S29 的ITS 序列及发育分析

以ITS1 和ITS4 为引物，在菌株S29 基因组DNA 中扩增出一条516bp 的序列，在GenBank 登入获得登入号(KC411775)。所得序列经BLAST 分析，结果表明该序列与1 株Podospora sp.XSD-39(序列EU273519.1)同源性达100%。在以DNAStar MegAlign 软件构建的系统发育树上，菌株S29 与Podospora sp.属的进化距离也最近(图4)。

图4 菌株S29 基于ITS-rDNA 的系统发育和序列距离分析Fig.4 Phylogenetic and sequence distances analysis of strain S29 based on ITS-rDNA sequences

3 讨论

本实验从94 株内生真菌中筛选出3 株有显著的抑制乙酰胆碱酯酶活性和清除DPPH·自由基能力的内生真菌。对内生真菌的发酵提取物进行TLC检测发现，菌株S29 的迁移率与石杉碱甲标准品接近，对菌株的发酵提取物进行HPLC 检测发现，菌株S29 菌丝体提取物保留时间与标准品非常相近，可以确定，菌株S29 的菌丝体中含有石杉碱甲，对菌株S29 进行经形态学和rDNA ITS 序列分析，判定此菌分类地位:子囊菌亚门(Mastigomycotina)核菌纲(Pyrenomycetes)球壳目(Sphaeriales)毛球壳科(Lasiosphaeriaceae)柄孢壳菌属(Podospora)。Podospora sp.属的植物分布非常广泛，孙若琼等［6］从12 株蛇足石杉中分离到一株可能产生石杉碱甲或其类似物的菌株190 号，对该菌株进行分子鉴定，该菌株为Podospora sp 属，可见该属的菌有产石杉碱甲的潜力。包丽霞等［7］从北细辛中分离到10 株菌，其中一株为Podospora sp.属的菌株，该菌株具有抗肿瘤的活性。可见Podospora sp.属真菌在植物中分布广泛，它们的次级代谢产物非常丰富。

近年来国内外学者在千层塔内生真菌的分离到了产石杉碱甲的菌株数株，对其产量进行了测定。黎万奎等［8］，从蛇足石杉中分离到的Acremonium sp.2F09P03B，产量为8.32 μg/mL，鞠錾等［9］通过改进培养条件，从柳杉叶马尾杉(Phlegmariurus crytomerianus)中分离出能产生石杉碱甲的内生真菌Blastomyces sp.HA15 和Botrytis sp.HA23，产石杉碱甲的产量为每克干菌丝20～30 μg。Zhu［10］等从蛇足石杉中分离到能产石杉碱甲的内生菌SLF14，其产量为每克干菌丝石杉碱甲含量为142.6 μg。现有的研究结果表明，从石杉科植物中也筛选出能产生石杉碱甲的内生真菌，这为石杉碱甲临床应用提供了新的来源。本实验筛选的菌株产石杉碱甲量还较低，难以产业化，因此对菌株进行改良，使石杉碱甲在宿主体内高效表达是未来研究的方向。

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