艾叶水提物及其发酵物体内外抗阴道毛滴虫作用

白 静， 胡 雷， 张 丽， 田春雨， 庞得全， 薄海美， 韩淑英*

(1. 河北联合大学，河北 唐山063000;2. 唐山市工人医院，河北 唐山063000)

滴虫性阴道炎是妇科常见病。目前临床上常采用甲硝唑治疗，但该药可导致消化、神经、血液、皮肤等系统的不良反应，且有潜在的致癌、致畸、致突变作用［1-2］。此外阴道毛滴虫对甲硝唑的耐药性为9.6%［3］。因此寻找更为安全有效的治疗药物是十分必要的。艾叶是我国传统中药，为菊科植物艾蒿Artemisi argyi Levl. et Vant. 的干燥叶。具有温经止血、散寒止痛、调经安胎、除湿止痒、通经活络等功效［4-5］，现代药理研究表明其具有镇痛、抗菌、抗病毒、镇咳、平喘、祛痰等药理作用［6-7］。民间常单独或组成复方制剂用于细菌性或霉菌性阴道炎的治疗［8］，对于是否能用于滴虫性阴道炎的治疗未见报道，本实验利用中药发酵技术，将艾叶水提物进行生物发酵，将所得艾叶发酵物与水提物进行疗效比较，以期获得更为有效的治疗阴道毛滴虫的药物。

1 材料

1.1 动物 SPF 级昆明小鼠，体质量18 ～22 g，雌性，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，生产许可证号SCXK ＜京＞2009-0008。

1.2 受试药物 艾叶水提物:将艾叶研碎，水浴加热煮沸2 h 后，4 层纱布过滤，将滤渣继续浸煮2 h，将两次滤液合并，浓缩成每100 mL 含生药100 g。艾叶发酵物:取高压灭菌后的增殖菌液体培养基(蛋白胨40 g，酵母浸粉20 g，葡萄糖40 g于1 000 mL 蒸馏水中)于无菌容器内，无菌环境下加安琪干酵母10 g/100 mL，置37 ℃恒温培养箱培养6 h。将活化增殖的酵母菌液加入等体积的上述艾叶水提物、6%蛋白胨、6%葡萄糖，混合均匀后继续发酵。发酵条件为:培养温度37 ℃，培养时间72 h。发酵结束后，将发酵物加入无水乙醇，使乙醇终体积分数达到70%，在70 ℃萃取4 h，将提取液离心15 min，2 500 r/min。取上清液在旋转蒸发仪上回收乙醇，回收乙醇后的剩余液即为醇提后的艾叶发酵物，每1 00 mL 艾叶发酵物含生药50 g。将上述艾叶水提物也稀释成50 g 生药/100 mL。阳性对照药物甲硝唑氯己定洗剂:每1 mL 含葡萄糖酸氯己定1.2 mg、甲硝唑0.2 mg，深圳佳泰药业有限公司，批号A110822L。

1.3 试剂 兔肝(河北联合大学实验动物中心提供);蛋白胨(北京奥博星生物技术有限责任公司，批号20120206);半胱氨酸盐酸盐(北京奥博星生物技术有限责任公司，批号20111012);麦芽糖(汕头市光华化学厂，批号20100815);胎牛血清(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，批号20100628011);注射用青霉素钠(华北制药股份有限公司，批号X1112407);注射用硫酸链霉素(华北制药股份有限公司，批号1110109);苯甲酸雌二醇 (天津必佳药业集团有限公司，批号20120101)。

1.4 阴道毛滴虫虫株来源 阴道毛滴虫取自河北联合大学附属医院妇科门诊并经医生确诊为滴虫性阴道炎患者的阴道分泌物，转种3 代后备用。

1.5 仪器 mLS-3750 高压灭菌器，日本SANYO公司;HR40-IIA2 生物安全柜，青岛海尔公司;Coic 倒置显微镜XDS-1B，重庆光电仪器有限公司;CO2恒温培养箱2123TC，美国SHEL-LAB 公司。

2 方法

2.1 体外试验 取灭菌小试管进行编号，设置艾叶水提物、艾叶发酵物、甲硝唑、空白对照4 个试验组，药物组分别设置6 个剂量，分别为1 ∶5，1 ∶10，1 ∶20，1 ∶40，1 ∶80，1 ∶160。1 ∶5 剂量配制方法为2.4 mL 肝浸汤培养液+0.6 mL 受试药物，从此管中取出1.5 mL 至下一管中，按2 倍稀释法依次类推进行稀释，空白组管中加入1.5 mL肝浸汤培养液。每管重复5 次。将转种第3 代滴虫用血球计数板计数，用培养液将其密度调至1 ×105个/mL。活虫比例99%以上，取0.5 mL 滴虫混悬液加入各试验管内，置37 ℃恒温箱内培养4、8、16、24 h 后，于倒置显微镜下观察，记录活虫数。其方法为用吸管吸取一滴阴道毛滴虫悬液(吸前用干净吸管吹打均匀)，滴入计数板凹槽内，至盖玻片下被液体充满为止，2 min 后，在显微镜下计数活虫体数(只计数对角线)对于压线的虫体只计数在上线和左线者，对于虫体团按单个虫体计数，虫体变圆、膨胀或收缩，鞭毛和波动膜不活动或轮廓不清、边缘不整、虫体裂解、溶解或虫体内完全颗粒变性者判定为死亡。计算各管活虫密度。按以下公式计算相对抑制率。相对抑制率=［(空白对照组滴虫密度-加药组滴虫密度)/空白对照组滴虫密度］× 100%，活虫数等于或高于接种数视为药物无效。

2.2 体内试验 昆明小鼠110 只，每只小鼠背部皮下注射苯甲酸雌二醇0.25 mL，隔天注射一次，连续3 次。于注射次日，除空白对照组外，其余各组用20 μL 微量加样器吸取密度为1 ×107个/mL虫体混悬液20 μL 注入小鼠阴道深部。于接种第5天进行阴道分泌物镜检，若镜检有大量活动阴道毛滴虫，即确定造模成功。将成模小鼠随机分为模型对照组、甲硝唑组(0.2 mg/mL)、艾叶水提物组(20 mg 生药/mL)，艾叶发酵物低、中、高剂量组(10、20、40 mg/mL)，每组15 只。次日除空白及模型组外，其余各组用微量加样器给予相应药物50 μL，连续阴道给药7 d。于给药第3 天及末次给药次日(给药第8 天)用50 μL 无菌生理盐水反复冲洗阴道，滴入血球计数板凹槽内，记录活虫体数。

2.3 阴道组织病理学检查 于给药第8 天阴道灌洗后，脱臼处死小鼠，解剖分离出每组小鼠阴道组织，常规石蜡包埋，HE 染色，镜下观察病理变化。切片标本镜下按充血、水肿、出血、浸润四项基本指标进行评分，无充血、水肿、出血、浸润评0 分，轻度评1 分，中度评2 分，重度评3 分，分别用“-”、“+”、“+ +”、“+ + +”来表示。评分标准见文献［9］。

2.4 统计方法 采用SPSS 13.0 软件进行统计分析，分析方法为重复测量设计方差分析及bonferroni 法。

3 结果与分析

3.1 体外试验 结果见表1。与艾叶水提物相比，同剂量下艾叶发酵物在4 ～24 h 体外对阴道毛滴虫抑制率均有显著差异(P ＜0.01)，艾叶发酵物在1 ∶5及1 ∶10 剂量下24 h 对滴虫的抑制率达到100%，可杀死全部虫体，且在1 ∶10 剂量下其作用优于甲硝唑(P ＜0.05);艾叶发酵物同一剂量随着时间延长，其对虫体抑制率也有升高趋势。

表1 不同剂量受试药物不同时间体外对阴道毛滴虫抑制率(±s，n=5)Tab.1 Inhibition ratio of tested drugs with various concentrations on trichomonas vaginalis at different times in vitro (±s，n=5)

表1 不同剂量受试药物不同时间体外对阴道毛滴虫抑制率(±s，n=5)Tab.1 Inhibition ratio of tested drugs with various concentrations on trichomonas vaginalis at different times in vitro (±s，n=5)

注:同剂量下与艾叶水提物比较，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;同剂量下与艾叶发酵物比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01

药物 稀释剂量 药物不同时间阴道毛滴虫抑制百分率/%4 h 8 h 16 h 24 h艾叶水 1 ∶5 46.22 ±10.37 46.41 ±7.87 48.81 ±10.82 47.25 ±3.67提物 1 ∶10 35.62 ±11.40 36.86 ±2.25 36.69 ±10.08 38.87 ±4.45 1 ∶20 13.85 ±6.66 15.65 ±5.77 13.25 ±2.86 10.17 ±7.04 1 ∶40 8.29 ±7.26 10.04 ±1.28 12.93 ±7.80 13.00 ±0.00 1 ∶80 2.22 ±0.37 4.41 ±0.87 5.81 ±0.82 7.25 ±0.67 1 ∶160 1.25 ±0.12 1.34 ±0.15 1.28 ±0.65 2.15 ±0.26艾叶发 1 ∶5 96.35 ±4.23 ＊＊ 99.21 ±7.34 ＊＊ 100.0 ±0.00 ＊＊ 100.0 ±0.00 ＊＊酵物 1 ∶10 96.26 ±4.14 ＊＊ 97.34 ±3.49 ＊＊ 99.33 ±3.26 ＊＊ 100.0 ±0.00 ＊＊1 ∶20 76.22 ±10.37 ＊＊ 89.41 ±7.87 ＊＊ 89.81 ±10.82 ＊＊ 90.25 ±3.67 ＊＊1 ∶40 55.62 ±11.40 ＊＊ 56.86 ±2.25 ＊＊ 56.69 ±10.08 ＊＊ 58.87 ±4.45＊＊1 ∶80 32.85 ±6.66 ＊＊ 35.65 ±5.77 ＊＊ 36.25 ±2.86 ＊＊ 38.17 ±7.04 ＊＊1 ∶160 20.29 ±7.26 ＊＊ 24.04 ±1.28 ＊＊ 26.93 ±7.80 ＊＊ 20.00 ±0.00 ＊＊甲硝唑 1 ∶5 97.16 ±2.46 100.0 ±0.00 100.0 ±0.00 100.0 ±0.00 1 ∶10 78.12 ±1.13 # 87.70 ±9.41 # 87.99 ±2.83 # 87.20 ±1.34 #1 ∶20 62.81 ±5.70 # 81.43 ±10.62 89.05 ±3.85 93.12 ±0.99 #1 ∶40 54.51 ±6.86 75.11 ±11.90 78.71 ±4.92 80.05 ±0.95 1 ∶80 35.42 ±6.59 40.33 ±16.03 41.05 ±2.75 41.99 ±3.73 1 ∶160 20.33 ±5.72 21.43 ±12.86 28.88 ±6.15 22.48 ±2.40

3.2 体内试验 与空白对照组比较，模型对照组小鼠阴道内镜检可见大量阴道毛滴虫。与模型对照组比较，艾叶水提物组和艾叶发酵物不同剂量组在给药第3 天和第8 天可明显减少阴道毛滴虫数量(P ＜0.05，P ＜0.01)，艾叶发酵物组作用更明显(P ＜0.01)，且随剂量增大，作用增强。见表2。

3.3 HE 染色阴道组织病理检查 表3、图1 结果显示，模型对照组小鼠阴道组织出现重度充血、水肿，有大量炎细胞浸润;与模型对照组比较，艾叶水提物组阴道组织病变程度亦较重，艾叶发酵物高剂量组小鼠轻度充血、水肿，少量炎细胞浸润，其治疗效果与甲硝唑相近。

表2 各组小鼠体内阴道毛滴虫密度(±s，n=15)Tab.2 Concentrations of trichomonas vaginalis in mice in each group (±s，n=15)

表2 各组小鼠体内阴道毛滴虫密度(±s，n=15)Tab.2 Concentrations of trichomonas vaginalis in mice in each group (±s，n=15)

注:与空白对照组比较，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与模型对照组比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01;与艾叶水提物组比较，Δ P ＜0.05，ΔΔP ＜0.01。下表同

组别 剂量/(mg 生药·mL -1) 给药第3 天虫体密度/(×102·mL -1) 给药第8 天虫体密度(×102·mL -1)空白对照组-0 0模型对照组 - 232.38 ±23.05＊＊ 341.69 ±36.59＊＊艾叶水提物组 20 165.26 ±13.56# 186.25 ±12.03#艾叶发酵物组 10 12.45 ±0.13##ΔΔ 9.06 ±0.10##ΔΔ艾叶发酵物组 20 0.95 ±0.25##ΔΔ 0.15 ±0.01##ΔΔ艾叶发酵物组 40 0.28 ±0.09##ΔΔ 0.03 ±0.00##ΔΔ甲硝唑组 0.2 0.17 ±0.01##ΔΔ 0.01 ±0.00##ΔΔ

表3 各组小鼠阴道病理组织评分动物数(±s，n=15)Tab.3 Number distribution of vaginal tissue damage scores in each group (±s，n=15)

表3 各组小鼠阴道病理组织评分动物数(±s，n=15)Tab.3 Number distribution of vaginal tissue damage scores in each group (±s，n=15)

组别 剂量/(mg 生药·mL -1) 0 分 1 分 2 分 3分15 0 0 0模型对照组＊＊ - 0 0 4 11艾叶水提物# 20 0 5 6 4艾叶发酵物低剂量组##ΔΔ 10 5 3 5 2艾叶发酵物中剂量组##ΔΔ 20 10 3 1 1艾叶发酵物高剂量组##ΔΔ 40 13 1 1 0甲硝唑组##ΔΔ空白对照组-0.2 12 2 1 0

图1 HE 染色各组小鼠阴道组织图Fig.1 HE staining figures of vaginal tissue of mice

4 讨论

艾叶为我国传统中药，目前常制作成艾灸用于临床［10］，传统工艺制备的艾叶水提物其药理作用较弱，临床并未得到广泛应用。为将艾叶开发成更有价值的新型药物，本研究采用中药发酵技术进行中药炮制，该方法是以中药为反应底物，通过微生物发酵过程对其结构进行修饰、转化从而达到提高中药药效、降低毒性、促进吸收、改善口味等目的［11-12］。目前该技术已成为一种新型的中药研究技术，并取得了一定的成绩。如用酵母菌发酵大黄，会使大黄总蒽醌、结合性蒽醌量稍有降低，分离型蒽醌的量会增加，从而起到减毒增效的作用［13］。王玉红等［14］将黄芪加入到灵芝发酵的过程中，使得多糖的成分发生变化，增加了产生新的物质的可能性。

本研究以中药艾叶为反应底物，通过酵母菌发酵过程对艾叶中成分进行修饰，以期得到更为有效的抗白色念珠菌治疗药物。结果表明在体外试验中，与艾叶水提物组相比，在相同剂量同一时间下艾叶发酵物组在体外对阴道毛滴虫的抑制作用相对较强(P ＜0.01)，艾叶发酵物在1 ∶5 及1 ∶10 剂量下24 h对滴虫的抑制率达到100%，且在1 ∶10剂量下作用优于甲硝唑(P ＜0.05)。在体内试验中与艾叶水提物比，艾叶发酵物不同剂量组小鼠阴道内阴道毛滴虫密度明显减少，于给药第8 天，中、高剂量作用更为明显，且阴道组织病理显示艾叶发酵物中、高剂量组各小鼠阴道组织病变程度明显减轻。体内外试验提示艾叶发酵物具有明显的抗阴道毛滴虫作用。但艾叶发酵物中何种成分发挥了该作用尚需进一步研究。

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