离子色谱法同时测定海产品中的硝酸盐、亚硝酸盐和多聚磷酸盐

邵宏宏，周向阳，王 琦，周秀锦，沈 飚，傅谧妮

（舟山出入境检验检疫局，浙江 舟山 316000）

离子色谱法同时测定海产品中的硝酸盐、亚硝酸盐和多聚磷酸盐

邵宏宏，周向阳，王 琦，周秀锦，沈 飚，傅谧妮

（舟山出入境检验检疫局，浙江 舟山 316000）

建立超声辅助提取离子色谱法测定海产品中硝酸盐、亚硝酸盐和多聚磷酸盐（包括正磷酸盐、焦磷酸盐、三聚磷酸盐和三偏磷酸盐）含量的方法，对样品中硝酸盐、亚硝酸盐和多聚磷酸盐的稳定性进行研究，并采用该法对典型海产品中的硝酸盐、亚硝酸盐和多聚磷酸盐含量进行测定。结果表明：采用亲水性阴离子交换分离柱，KOH溶液为淋洗液作梯度淋洗，硝酸盐、亚硝酸盐和多聚磷酸盐的线性相关系数在0.998 1～0.999 8之间，回收率为79.2%～93.6%，相对标准偏差小于8.2%。经处理后的样品中，焦磷酸盐、三聚磷酸盐和三偏磷酸盐的总量在14 h内保持稳定。利用该法对东海地区典型海产品中的硝酸盐、亚硝酸盐和多聚磷酸盐进行了测定，结果显示不同品种的海产品中硝酸盐、亚硝酸盐和多聚磷酸盐含量分布有较大差异，除其中一份虾制品中多聚磷酸盐含量超过5 g/kg外，其余均符合国家限量标准。

离子色谱；亚硝酸盐；硝酸盐；多聚磷酸盐；海产品

硝酸盐是海水的重要营养盐，海产品中的硝酸盐在细菌和酶的作用下会还原成亚硝酸盐，亚硝酸盐与二级胺反应，生成强致癌物-亚硝胺，诱发消化系统的癌变[1]；一些贮存时间较长、有腐败变质倾向且蛋白质含量较高的海产品其所含亚硝酸盐含量也较高[2-3]；另外由于加工贮存过程中的质量保障体系不健全也会导致部分海产品中含有较高的亚硝酸盐。关于亚硝酸盐中毒的事件也时有报道[4]，因此我国对食品中硝酸和亚硝酸盐提出了明确的限量标准[5-6]。目前针对该类物质的检测主要采用离子色谱法和分光光度计法[7-12]。

多聚磷酸盐是一类性能优异的保水剂和抗冻剂[13]，并对水产品中的微生物生长有抑制作用[14-15]，因此被水产企业大量用于海产品特别是冷冻海产品的加工和保存过程中。在水产加工中，多聚磷酸盐主要是指焦磷酸盐、三聚磷酸盐和三偏磷酸盐。但是，其过量摄入会降低钙吸收导致肌体钙磷流失，因此各国对水产品中多聚磷酸盐含量作了明确的限量要求[16-17]。我国输欧水产品曾多次被欧盟通报多聚磷酸盐超标问题，且其5 g/kg的限量要求针对焦磷酸盐、三聚磷酸盐和三偏磷酸盐的总和，即不包含正磷酸盐的含量，因生物体中均含有一定量的正磷酸盐，传统方法中通过测定总磷含量对多聚磷酸盐的含量进行判定已不能满足实际需求。目前我国还没有现行的检测水产品中多聚磷酸盐含量的国家标准和行业标准。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

各类海产品均来自于浙江舟山市各大水产加工企业，新鲜海捕产品及制品取可食部分，冻制品等解冻后匀浆于－22 ℃保存备用。

三氟乙酸、三氯乙酸均为分析纯；去离子水（电阻率18.2 MΩ·cm），经0.22 μm微孔滤膜过滤后使用；亚硝酸盐（CAS：7632-00-0，纯度99.999%）和硝酸盐（CAS：7631-99-4，纯度99.999%）（标准溶液质量浓度均为1 000 mg/L于4 ℃保存） 美国NSI公司；多聚磷酸盐标准品：正磷酸钠（CAS：7601-54-9，纯度≥94.0%）、焦磷酸钠（CAS：7722-88-5，纯度≥98.0%） 美国Fluka公司；三聚磷酸盐纯度（CAS：7758-29-4，纯度≥85.0%）、三偏磷酸盐（CAS：7601-54-9，纯度≥95.0%） 美国Sigma-Aldrich公司。分别准确称取一定量多聚磷酸盐标准品，用少量水溶解，加水定容至100 mL。使用时用超纯水将上述标准品逐级稀释成不同质量浓度的混合标准溶液，上机前以0.22 μm微孔滤膜过滤。

Dionex ICS-3000离子色谱仪（配电导检测器，Chromeleon色谱工作站，AMMS-ICE 300（4 mm）抑制器，IonPac AS11-HC分离柱，IonPac AG11-HC保护柱）美国Thermo Fisher 公司；天平（感量0.000 1 g）；超声波清洗器 德国Elma公司；MSI漩涡振荡器 德国IKA公司；3-18K低温高速离心机 美国Sigma公司；0.22 μm微孔滤膜、C18-SPE前处理小柱 天津富集科技有限公司；0.22 μm尼龙滤膜过滤头。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件

如果说更先进的科技拉近了用户与未来之间的距离，那么舒适的乘坐区域则让用户更切身地体会到豪华的含义。经过精心挑选的内饰材料保证了全新BMW X5出色的视觉效果，结合璀璨水晶般材质的换挡杆、四区空调系统、星空全景天窗、智能感应氛围灯、迎宾光毯等配置之后，创造出了更具质感的乘坐体验。此外，全新BMW X5的驾驶者辅助系统更加丰富，将舒适性和安全性推向一个新高度。增强的创新驾驶辅助系统包括车道变更辅助功能、车道保持辅助功能和交通堵塞驾驶辅助功能等。

淋洗液：KOH溶液梯度淋洗，流速1.0 mL/min；抑制器：自动抑制模式，抑制电流200 mA；检测器：抑制型电导检测器；进样量：30 μL；柱温：30 ℃；以保留时间定性，峰面积定量。

1.2.2 样品前处理

1.2.2.1 样品的提取

将待测的海产品样品充分混匀并研磨至匀浆，装入容器内，密封、冷藏备用；准确称取经前处理的海产品样品，放于玻璃容器中，加入50 mL超纯水，制成均质系统，封盖后超声波提取30 min。

1.2.2.2 样品的净化

海产品中含有大量的蛋白质、脂肪和一些影响待测出峰的无机离子，会污染分离柱并影响柱子的使用寿命。三氟乙酸具有良好的蛋白质沉淀效果，毒性较小且氟离子出峰不会对待测物质产生干扰。因此采用三氟乙酸与C18-SPE柱相结合的方式进行净化，可避免有机基质对离子色谱的影响，且能保证较好的回收率。将超声后的样品倒入离心管中，7 000 r/min离心10 min，过滤，取滤液20 mL，加3 mL 20%三氟乙酸溶液混合，放入0～4 ℃冰箱中保存30 min。将蛋白质沉淀后的样品在8 000 r/min的离心机中离心10 min，过滤后将滤液过活化好的C18柱，去除初过柱液3 mL，盛接过柱液，0.22 μm尼龙滤膜过滤后收集于5 mL自动进样器样品瓶中，供ISC-3000离子色谱仪测定。

1.2.3 样品测定

采用标准曲线法测定，取硝酸盐、亚硝酸盐、正磷酸盐、焦磷酸盐、三聚磷酸盐和三偏磷酸盐配制成系列质量浓度，以质量浓度对电导响应值求出回归方程与相关系数，根据标准曲线确定待测样品中硝酸盐、亚硝酸盐、正磷酸盐、焦磷酸盐、三聚磷酸盐和三偏磷酸盐的含量。

2 结果与分析

2.1 色谱条件及样品离子色谱图

2.1.1 淋洗液的选择

离子色谱采用的抑制电导检测法测定强酸离子，会有很好的检测信号以及线性，HC为淋洗液因其抑制产物是H2CO3，具有一定的离解度，并且随着淋洗液浓度的变化，H2CO3浓度也发生变化，因此不适用于做梯度淋洗。而OH－经抑制器后变成水，其背景电导较小，结合在线淋洗液发生系统，可避免淋洗液与空气的接触，可得到所需准确浓度的无污染的氢氧化钾进行梯度淋洗，并有效减缓梯度淋洗时基线升高。因此用氢氧化钾作淋洗液，电导法检测有机酸具有较强的检测信号和很好的系统稳定性。

2.1.2 色谱条件的选择

表1 梯度洗脱程序Table1 Gradient elution program

图1 1离子色谱图Fig.1 Ion chromatogram of nitrate, nitrite and polyphosphates

图2 常见阴离子与离子色谱图Fig.2 Ion chromatogram of nitrate, nitrite , polyphosphates and common anions

由于海产品中富含无机阴离子，采用IonPac AS11-HC色谱柱，该色谱柱可有效分离各种阴离子。硝酸与亚硝酸根可在较低淋洗液浓度下即可分离，但是在低浓度等度淋洗时，硝酸根、亚硝酸根易与其他阴离子出现共淋洗现象。因此在亚硝酸根出峰后进一步降低淋洗液浓度，将硝酸根与其他阴离子有效分离。多聚磷酸盐的电荷数和离子半径相差较大，与固定相的亲合力也相差较大，等浓度淋洗很难达到理想的分离效果，三聚磷酸盐和三偏磷酸盐在中低浓度的淋洗液条件下，比较难分离，为达到最佳的分离效果，应采用较高的淋洗液浓度。为保持较低的背景电导，当淋洗液浓度升高时，抑制电流也要相应的加大。然而，较高的淋洗液浓度会降低抑制器的寿命。在本方法中，当硝酸根出峰后将淋洗液浓度调整到70 mmol/L，即可使4 种多聚磷酸盐有效分离，又最大程度上减少了对抑制器的损害。经过多次实验，最终确定梯度洗脱程序如表1所示。在此梯度淋洗程序下，可以避免海产品中含量较多的F－、Cl－、SO42－、Br－等常规阴离子的干扰见图1，又可使待测离子较好地分离，见图2。

2.2 线性范围、精密度和检出限

配制一系列质量浓度的硝酸盐、亚硝酸盐和多聚磷酸盐的混合标准溶液，在最佳实验条件下制作标准曲线，以目标化合物质量浓度为横坐标，标准品峰面积响应值为纵坐标，绘制标准曲线。其质量浓度和峰面积具有良好的线性关系，标准曲线及线性关系如表2所示，4 种多聚磷酸盐的质量浓度以五氧化二磷计。并用浓度稀释法在3 倍信噪比（RSN）时测得检出限，能满足食品安全的检测需要。

表2 硝酸盐、亚硝酸盐和多聚磷酸盐的线性关系、检出限、工作曲线方程Table2 Linear ranges, detection limits, and linear regression equations for nitrate, nitrite and polyphosphates

2.3 加标回收率

精密称取鱼肉样品5.0 g，定量加入不同水平标准品，每个梯度6 个平行样品，经前处理后测定其加标回收率，并计算平均回收率，亚硝酸盐含量按亚硝酸钠计，硝酸盐含量以硝酸钠计。结果表明，平均回收率在79.2%～93.6%（表3），相对标准偏差（n=6）在8.2%以下，符合定量分析的要求，结果见表3。因生物体内自身含有磷酸盐，因此空白样品色谱图中出现磷酸根见图3，加标样品色谱图见图4。

表3 回收率实验结果（n=6）Table3 Results of spiked recovery experiments (n=6)

图3 空白样品离子色谱图Fig.3 Ion chromatogram of blank sample

图4 样品加标离子色谱图Fig.4 Ion chromatogram of spiked sample

2.4 样品稳定性实验

经前处理好的样品，保存0、3、5、7、10、12、14、24 h后分别测定硝酸盐、亚硝酸盐、正磷酸盐、焦磷酸盐、三聚磷酸盐和三偏磷酸盐质量浓度值，其质量浓度变化如图5所示。由图5B可知，在常温条件下，样品中的亚硝酸盐随着放置时间的延长，质量浓度逐渐下降，而同时硝酸盐的质量浓度变化基本与之相反。这说明亚硝酸盐在常温条件下不稳定，与氧气作用生成硝酸盐导致硝酸盐含量增大。

多聚磷酸盐中三偏磷酸盐的稳定性较差，且在14 h后质量浓度明显下降，反之正磷酸盐、焦磷酸盐和三聚磷酸盐的质量浓度随时间推移升高。这可能由于三偏磷酸盐不稳定一部分转化成三聚磷酸盐或者直接分解成焦磷酸和正磷酸盐[21-22]。另外，由于国内外的相关法规上对多聚磷酸盐在水产品中应用的限量规定，均以焦磷酸盐、三聚磷酸盐及三偏磷酸盐质量浓度的总和（以五氧化二磷计）来进行判断，对这3 种磷酸盐的总质量浓度的变化进行了研究，并发现在14 h内除正磷酸盐外其余3 种磷酸盐的总质量浓度保持不变，因此，虽然各个磷酸盐的质量浓度有所变化，但是在样品处理完成后的14 h内进行检测，不会影响根据限量要求对产品质量进行的评判。

图5 稳定性曲线Fig.5 Stability curves

2.5 样品的测定

采用随机取样法分别采集舟山市水产品加工厂和流通市场共16 个不同种类的样品，用上述的样品前处理和色谱条件进行测定，结果见表4。

表4 样品的含量测定Table4 Contents of nitrate, nitrite and polyphosphate in 16 samples from different species

对虾类、鱼类、贝类、蟹类等各类海产品及其制品包括干品等检测数据分析发现，大部分的海产品中基本不含有亚硝酸盐，只在虾干中发现含亚硝酸盐。海产品中普遍存在较低的硝酸盐，且低于国家的限量标准。正磷酸盐在各种海产品中均有一定的含量，且相同种类的海产品其正磷酸盐含量也存在一定的差距，这可能与海产品的冷冻时间长短而导致的肌肉中三磷酸腺苷水解的程度不同有关。多聚磷酸盐在虾类制品中包括应用较为普遍，且有一份虾制品其多聚磷酸盐含量超过限量标准（5 g/kg）。含多聚磷酸盐的海产品中三聚磷酸盐的含量相对较高，因其持水性和抑菌效果均优于焦磷酸盐和三偏磷酸盐。另外对水产品加工时所用的添加剂检测显示其中主要成分为三聚磷酸盐，与本实验中部分样品中的三聚磷酸盐残留量较高的检测结果相一致。

3 结 论

本实验采用离子色谱法对海产品中的硝酸盐、亚硝酸盐、多聚磷酸盐进行了分析测试研究，在样品的前处理过程中，根据待测离子易溶于水相的特点，选择了较为快捷、有效的提取、净化方法，待测组分均有较好的回收率。在色谱分析过程中，针对待测离子各自的特点选择了有效地梯度淋洗方式，具有较好的分离效果。该检测方法简单易行、结果可靠，可实现海产品中多种添加剂的同时检测，在降低了检测成本，同时提高了检测效率，并可为其他食品中亚硝酸和多聚磷酸盐的快速检测提供依据。

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Simultaneous Determination of Nitrate, Nitrite and Polyphosphates in Seafood by Ion Chromatography

SHAO Hong-hong, ZHOU Xiang-yang, WANG Qi, ZHOU Xiu-jin, SHEN Biao, FU Mi-ni
(Zhoushan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Zhoushan 316000, China)

A method for determining nitrate, nitrite and polyphosphates including phosphate, pyrophosphate, triphosphate and trimetaphosphate in seafood using ion chromatography (IC) was proposed. The stability and contents of these compounds in seafood were also investigated. The separation was achieved on hydrophilic anion exchange column through gradient elution using potassium hydroxide as the elutant. The determination coefficients of the developed linear equations for these analytes were in the range of 0.998 1-0.999 8, and the recoveries of spiked samples ranged from 79.2% to 93.6% with RSD less than 8.2%. The total content of pyrophosphate, triphosphate and trimetaphosphate was stable within 14 h. This method has been successfully applied to the determination of pyrophosphate, triphosphate and trimetaphosphate in different kinds of seafood products from the East China Sea. The results showed that a wide variation in the contents of nitrate, nitrite and polyphosphates existed among different seafood products, and all residual contents met the national maximum allowable residue levels except that polyphosphates in one sample were more than 5 g/kg.

ion chromatography; nitrate; nitrite; polyphosphates; seafood

O657.75

A

1002-6630（2014）20-0248-05

10.7506/spkx1002-6630-201420049

2013-11-21

舟山市科技计划项目（2012C23005）；浙江检验检疫科技计划项目（ZK2008019）

邵宏宏（1981—），女，工程师，硕士，研究方向为色谱分离分析。E-mail：shh@zs.ziq.gov.cn