电针曲池与上巨虚穴对溃疡性结肠炎大鼠NF-κB及HMGB1表达的影响

杨璐佳，张 泓 *，张雨辰 ，邓石峰，王珍珍 ，粟艳梅

（1.湖南中医药大学针灸推拿学院，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第二附属医院，湖南 长沙 410005）

电针曲池与上巨虚穴对溃疡性结肠炎大鼠NF-κB及HMGB1表达的影响

杨璐佳1，张 泓1*，张雨辰2，邓石峰1，王珍珍1，粟艳梅1

（1.湖南中医药大学针灸推拿学院，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第二附属医院，湖南 长沙 410005）

目的 观察电针溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）大鼠大肠经经合穴“曲池”、下合穴“上巨虚”后对核因子-κB((nuclearfactorκB，NF-κB)、高迁移率族蛋白 1(high mobility group box 1， HMGB1)表达的影响。 方法 以 2-4-6 三硝基苯磺酸（TNBS）/乙醇溶液灌肠诱导建立SD大鼠UC模型，曲池组与上巨虚组造模成功后分别电针曲池穴和上巨虚穴，连续治疗10 d，第11天处死所有大鼠，肉眼观察大鼠结肠溃疡评分,提取结肠组织检测其NF-κB、HMGB1的表达。结果 造模成功后，模型组大鼠结肠肉眼溃疡评分、结肠组织NF-κB、HMGB1表达均明显增高（P<0.01）；电针治疗后，上巨虚组降低溃疡评分（P<0.01），曲池组、上巨虚组均能降低NF-κB、HMGB1在结肠中的表达（P<0.01）；与曲池组相比，上巨虚组溃疡评分及NF-κB、HMGB1表达均明显降低（P<0.01）。结论 电针对UC的治疗作用可能是通过调节NF-κB、HMGB1等来实现的；电针上巨虚的治疗作用优于曲池，说明“上巨虚”存在相对特异性，部分证实“合治内府”中的“合”主要应指下合穴，其具体内涵仍需进一步研究。

溃疡性结肠炎；电针；核因子-κB；高迁移率族蛋白1；大鼠；曲池；上巨虚

《灵枢·邪气脏腑病形》记载：“荥输治外经,合治内府”，“治内府奈何？取之于合”。这些理论成为后世合穴临床应用的基本指导原则。然对于手足六阳经而言，有上、下合穴之分，即通常所指的“经合穴”与“腑合穴”。合治内府之“合”是特指某一类合穴还是包括了上、下合穴？迄今为止相关医籍或文献均未有明确答案，借用现代技术对这一理论的系统性研究也很少。本文以溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）大鼠为研究对象，以电针曲池、上巨虚为干预手段，观察电针对UC大鼠结肠组织中高迁移率族蛋白1(high mobility group box 1,HMGB1)、核因子-κB((nuclearfactorκB,NF-κB)表达的影响，初步探讨电针手阳明大肠经上、下合穴曲池与上巨虚对UC可能的治疗机制及“合治内府”的部分内涵，也为临床应用合穴治疗腑病提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物与分组 SPF级SD大鼠40只，雌雄各半，体质量260～300 g。饲养温度20～25℃，湿度50%～70%。（动物及饲料由湖南中医药大学动物实验中心提供，合格证编号：4304701041）。所有大鼠适应性常规饲养5 d后，按性别、体质量随机分为空白组、模型组、曲池组、上巨虚组，每组10只。实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》[1]相关动物伦理学标准的条例。

1.1.2 主要试剂 2-4-6三硝基苯磺酸（美国sigma公司），即用型SABC免疫组化染色试剂盒、棕黄色DAB显色剂（武汉博士德公司），NF-κB多克隆抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司），HMGB1抗体试剂盒（南京建成生物科技有限公司）等。

1.1.3 主要仪器 SDZ-V型电子针疗仪（苏州医疗用品厂有限公司)，毫针（规格0.3×25 mm,苏州医疗用品厂），全套手术器械、CBV-1500A型无菌工作台（上海瑞仰净化装备有限公司），Motic Tek3.1图像采集系统（厦门产），Bx-70显微镜成像系统（日本OLYMPUG公司）等。

1.2 造模方法

空白组以生理盐水替代2-4-6三硝基苯磺酸（TNBS）/乙醇溶液造模，不另处理，其余组参照文献[2]进行造模：造模前大鼠禁食不禁水24 h，以25%乌拉坦腹腔注射麻醉（0.5 mL/100 g），用大鼠灌胃针头轻轻从肛门插入，深度8 cm，用注射器注入含30 mg三硝基苯磺酸（即2.5%TNBS 0.6 mL）的50%乙醇溶液0.85 mL,并迅速捏紧肛门（防止液体溢出），5 min后仰卧归笼。待其清醒后常规饲养。观察大鼠造模后有无出现懒动、拱背、厌食、大便次数增多、便软或稀、大便末端有黏液等表现，有1项记1分，无记0分并累计总分，2分及以上提示造模成功。

1.3 治疗方法

1.3.1 处理方法 造模成功后第二天开始:空白组不予处理；模型组捆绑固定，不予治疗；曲池组捆绑固定后，取双侧曲池穴进行电针治疗；上巨虚组捆绑固定后，取双侧上巨虚穴进行电针治疗。每次干预时间为30 min,每天1次，连续10 d。

1.3.2 穴位定位及针刺方法 根据由华兴邦[3]等制定的《实验动物穴位图谱》和李忠仁[4]主编的《实验针灸学》及拟人对照法定位:曲池穴取双侧前肢桡骨近端肘关节外侧前方的凹陷中，直刺4 mm；上巨虚穴取双侧后肢上足三里穴下约5 mm处，直刺7 mm。

1.3.3 电针参数 针刺各穴位并捻转有紧滞感后以针柄链接SDZ-V型华佗牌电针治疗仪，参数为疏密波（10/50 Hz），左正右负，以肢体出现震颤为度。

1.4 标本采集与测定方法

1.4.1 标本采集 治疗10 d后，第11天用25%乌拉坦按0.5 mL/100 g将大鼠麻醉，沿腹正中线打开腹腔，从肠近端至远端取200 mg结肠组织（约长5 cm），沿肠系膜纵轴方向剪开肠腔，迅速用冰生理盐水冲洗后，先行肉眼下溃疡及炎症评分，再取其中约2 cm长的组织予10%福尔马林溶液固定，石蜡包埋以备免疫组化法检测HMGB1、NF-kB阳性表达的强度。

1.4.2 溃疡评分方法 参照朱峰等[5]的评分标准：0分 无损伤；1分 黏膜充血、水肿,但未出现溃疡；2分 黏膜充血、水肿、轻度糜烂,无溃疡；3分 黏膜充血、水肿、中度糜烂,有单个溃疡；4分 黏膜充血、水肿、高度糜烂,有多处溃疡；5分 黏膜充血、水肿、重度糜烂,有>1 cm溃疡。

1.4.3 HMGB1、NF-kB检测 严格按照HMGB1及NF-kB的抗体试剂盒操作流程在湖南中医药大学实验楼5楼免疫组化室进行检测。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠结肠溃疡肉眼观察及评分比较

空白组大鼠结肠黏膜基本正常，未见糜烂溃疡、穿孔出血等；模型组大鼠结肠组织黏膜充血严重，水肿明显，表面欠光滑，呈糜烂状，严重部位可见溃疡甚至出血；曲池组黏膜表面不平整，充血、水肿较模型组稍轻，溃疡数目及深度不及模型组明显；上巨虚组结肠组织黏膜表面较平滑，无明显充血，亦未见明显出血糜烂，肉眼观察较曲池组更接近空白组。如图1所示。

图1 各组大鼠结肠组织溃疡肉眼观察图

溃疡评分：与空白组相比,模型组与曲池组明显升高，差异有显著统计学意义（P＜0.01）；与模型组相比,曲池组有下降趋势但无统计学意义（P>0.05），上巨虚组明显降低,差异有显著统计学意义（P＜0.01）；与曲池组相比，上巨虚组明显降低,差异有显著统计学意义（P＜0.01）。 结果见表 1。

2.2 各组大鼠结肠中NF-κB、HMGB1表达的比较

与空白组比较，模型组、曲池组及上巨虚组的NF-κB、HMGB1表达均有不同程度的增高，且模型组、曲池组差异均有显著统计学意义（P<0.01），上巨虚组有统计学意义（P<0.05，P<0.01）；与模型组比较，曲池组与上巨虚组NF-κB、HMGB1的表达均有所下降，差异有显著统计学意义（P<0.01）；另外，上巨虚组NF-κB、HMGB1的表达明显低于曲池组，差异有显著统计学意义（P<0.01）。结果见表2。

表1 各组大鼠结肠溃疡评分比较 （）

表1 各组大鼠结肠溃疡评分比较 （）

注:与空白组比较△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型组比较，▲▲P＜0.01；与曲池组比较，##P＜0.01。 下表同。

组别空白组模型组曲池组上巨虚组例数10 10 10 10溃疡评分（分）0.20±0.42 2.10±0.88△△2.01±0.58△△0.60±0.70▲▲﹟﹟

表2 各组大鼠结肠中NF-κB、HMGB1平均光密度值的比较 （）

表2 各组大鼠结肠中NF-κB、HMGB1平均光密度值的比较 （）

组别空白组模型组曲池组上巨虚组例数10 10 10 10 NF-κB 0.22±0.04 0.37±0.05△△0.32±0.03△△▲▲0.26±0.03△▲▲﹟﹟HMGB1 0.25±0.03 0.39±0.02△△0.34±0.03△△▲▲0.29±0.03△△▲▲﹟﹟

3 讨论

针刺穴位产生的免疫调节作用早已在实验与临床中得到广泛验证[6]。HMGB1是一种重要的晚期致炎因子，在感染及炎症时其血浆水平显著升高，起到重要的促炎效应，参与多种自身免疫性疾病尤其是关节炎、结肠炎等发病过程，可能是调控胃肠黏膜免疫损伤机制的重要信息分子[7]。NF-κB是一类在炎症和免疫反应过程中普遍存在的转录因子，广泛参与多种基因特别是免疫炎性反应相关基因的表达调控，从而参与UC肠道的炎症和免疫反应[8-11]，因此，抑制NF-κB的表达与释放，可以降低包括HMGB1在内的炎性因子的水平，减轻UC肠道的炎性和免疫反应，进而有效地保护肠黏膜。

本实验中，与空白组比较，模型组肉眼溃疡评分、结肠组织NF-κB、HMGB1表达均明显增高，表明造模成功的同时也提示NF-κB、HMGB1参与了UC疾病的发展变化过程。相比模型组，电针曲池、上巨虚组均能降低UC的溃疡评分及NF-κB、HMGB1在结肠中的表达，表明电针曲池、上巨虚组可通过降低NF-κB、HMGB1表达有效减轻肠道炎症。进一步比较发现，上巨虚组相对于曲池组，溃疡评分、NF-κB、HMGB1的表达均明显降低，说明上巨虚组的抗炎作用要明显优于曲池组，从一定程度上证实了下合穴存在相对特异性。

综上,本研究表明：(1)电针对UC的治疗作用可能是通过调节 NF-κB、HMGB1 等来实现的；(2)“上巨虚”存在相对特异性，据此认为“合治内府”中的“合”主要应指下合穴，其具体内涵仍需进一步研究。

[1]Monique Adolphe,André-Laurent Parodi.Ethical issues in animal experimentation[J].Bulletin de L'Academie Nationale de Medicine,2009,193(8):1 803-1 804.

[2]李志晋，詹丽英,等.溃疡性结肠炎大鼠肠黏膜超微结构变化及肠组织中P-选择素表达的研究.广西医科大学学报[J].2007,24(2):183-185.

[3]华兴邦.大白鼠穴位图谱的研究 [J].实验动物与动物实验，1991,1（1）：13-15.

[4]李忠仁.实验针灸学[M].北京:中国中医药出版社，2003：425-431.

[5]朱 峰.细胞免疫反应性炎症性肠病动物模型的建立.中国医学科学院学报[J].1998,20(4):271-277.

[6]黄 诚，韩立民.电针与免疫[J].山东医药.2012,16(4):91-92.

[7]Pisetsky DS,Erlandsson-Harris H,Andersson U.High-mobility group box protein 1(HMGB1):an alarmin mediating the pathogenesis of rheumatic disease[J].Arthritis Res Ther,2008,10:209-219.

[8]Lee JI Burckart G J Nuclear factor kappa Binportant transcription factor and therapeutic target[J].J C lin Pham acol 1998,38(11)：981-993.

[9]李海龙,程小丽，董晓丽，等.NF-KB和ICAM-1在溃疡性结肠炎大鼠结肠中表达及中药干预的影响[J].中国老年学杂志.2011,15（3）：1 594-1 596.

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[11]冀来喜，程艳婷，闰丽萍，等.电针“肠病方”腧穴对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织核因子—kbp65及血清白介素一4的影响[J].针刺研究.2013,1（2）：26-30.

（本文编辑 匡静之）

The Effect of Quchi and Shangjuxu Acupoints on the Level of NF-κB,HMGB1 in Ulcerative Colitis Rats Models via Electro-acupuncture

YANG Lujia1,ZHANG Hong1*,ZHANG Yuchen2,DENG Shifeng1,WANG Zhenzhen1,SU Yanmei1
（1.College of Acupuncture and Massage,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China;2.The Second Affiliated Hospital of HUCM,Changsha,Hunan 410005,China）

ObjectiveTo observetheexpression levelof high mobility group box 1(HMGB1),nuclearfactorκB(NF-κB)in the ulcerative colitis(UC)rats and study related mechanism to further understand the meaning of"He-sea points"in"curing viscera diseases by He-sea points"after electro-acupuncturing"Quchi"and"Shangjuxu"acupoints.Methods The UC rats models were giventrinitrobenzene sulphoneacid(TNBS)/ethanol enema,then"Quchi"group and"Shangjuxu"group respectively

electro-acupuncture at"Quchi"and"Shangjuxu"acupoints for 10 consecutive days.24h after the last treatment,we dissected all rats and collected colon tissue to observe ulcer score and the expression level of HMGB1 and NF-κB.Results ① Compared with control group,th ulcer score，HMGB1 and NF-κB signifcantly increased(P＜0.01)in model group. ② Compared with model group,"Quchi"group and"Shangjuxu"group made obvious decrease in the ulcer score，HMGB1 and NF-κB(P＜0.01). ③ Compared with"Quchi"group,the ulcer score，HMGB1 and NF-κB decreased significantly(P＜0.01).Conclusion① Both of the large intestinal meridian's lower He-sea point"Shangjuxu"and upper He-sea point"Quchi"can improve the UC through decreasing the ulcer score,HMGB1 and NF-κB of the ulcerative colitis.②The treatment effect of"Shangjuxu"on the UC is better than"Quchi",it shows that"Shangjuxu"possess relative specificity.③Our results impartially suggest that"He points"in"curing viscera diseases by He points"mainly implicates the lower He point,and the specific mechanism still needs further research.

ulcerative colitis;electro-acupuncture;NF-κB;HMGB1;rat;Quchi point;Shangjuxu point

R574.62;R246.1

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2014.05,017,058,04

2014－02－25

国家自然科学基金资助项目（81173327/H2718）;湖南省教育厅创新平台项目 (11K047)。

杨璐佳，女，在读硕士研究生，研究方向：针灸治病机制的研究。

*张泓，男，教授，博士研究生导师，E-mail:zh5381271@sina.com。