优化GC检测欧李酒香气成分的萃取条件

陈 臣，李 艳，2，牟德华，*

（1.河北科技大学生物科学与工程学院，河北石家庄050018；2.河北省发酵工程技术研究中心，河北石家庄050018）

香气指标是果酒感官质量的重要组成部分，香气成分的种类、含量、感官阈值及成分间的综合作用决定着果酒的风味和典型性[1]。对果酒香气成分的研究，是评价其感官品质、分析香气特征的重要手段。

固相微萃取技术（Solid Phase M icroextraction，SPME）是20世纪90年代发展起来的一种样品前处理技术，相对于传统的液液萃取法，它以无需有机溶剂，分析样品量少，操作简单、快速，集采样、萃取、浓缩、进样、解析于一体的特点而得到广泛应用[2]。该法能最大程度的减少被测香气成分的损失和变化，得到完整、真实的分析结果。顶空固相微萃取法是指在热力学平衡的蒸汽相与被分析样同时存在于一个密闭系统中，取上部气体。Fedrizzi B等采用顶空固相微萃取方法萃取葡萄酒中3-巯基-1-己醇和3-巯基己基乙酸酯，来研究这两种物质在葡萄酒后熟过程中的变化及对葡萄酒风味的影响[3]。Perestrelo R等在研究葡萄牙Terras Madeirenses红酒香气成分时，采用了顶空固相微萃取结合气相质谱的方法，检测到酯类、醇类、酸类、萜烯类等60多种香气物质[4]。采用顶空固相微萃取法结合GC-FID检测欧李果酒中的香气成分目前未见报道。

本文通过响应面分析法，对影响欧李发酵酒中香气成分SPME萃取效果较大的3个主要因素进行了优化研究，包括：加盐量、萃取温度和萃取时间。并以优化后的萃取条件结合GC-FID对欧李发酵酒香气成分进行了检测分析，目的是客观精确地测定欧李果酒中痕量的香气成分，为改善和提高欧李果酒的风味奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

苯乙醇（≥99.0%）、仲辛醇（≥99.0%） 成都艾科达化学试剂有限公司；己酸乙酯（≥99.0%） 天津天泰精细化学品有限公司；正丙醇（≥99.8%） 天津博迪化工有限公司；己醇（≥99.0%） 天津科密欧试剂开发中心；氯化钠（≥99.5%）、无水乙醇（≥99.7%）、异丁醇（≥99.0%）、异戊醇（≥98.5%） 天津市永大化学试剂有限公司；乙酸异戊酯（≥99.0%）、丁二酸二乙酯（≥99.0%）、己酸（≥98.5%）、乳酸乙酯（≥99.0%） 天津市光复精细化工研究所；高纯氮气（纯度99.999%） 石家庄市桥西西三教制氧站。

DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 巩义市英峪华仪器厂；GC 7820A配有FID检测器 美国安捷伦公司；2cm-50/30μm DVB/Carboxen/PDMS萃取头、100μm PDMS萃取头及萃取手柄 美国Supelco公司。

1.2 实验方法

1.2.1 欧李酒酿造工艺流程 欧李果分选→手工破碎、去核→加SO2、果胶酶→调整成分→接种酵母菌→酒精发酵→压榨、过滤取原酒→冷藏陈酿[5-6]→成分分析。

1.2.2 萃取条件单因素实验 萃取头优选：DVB/ Carboxen/PDMS和PDMS两种萃取头在使用前分别按照说明书进行老化。老化后的萃取头分别以5m L欧李酒样加到20m L顶空萃取瓶中，加入2g NaCl，在30℃下于磁力加热搅拌器上平衡15m in，磁力搅拌转速2000r/m in，将萃取头插至萃取瓶液面上方，在30℃下萃取30m in，GC解吸3m in，以色谱峰面积和峰型来衡量萃取头的萃取效果。

采用优选的萃取头，以5m L欧李酒样加到20m L顶空萃取瓶中，磁力加热搅拌器上平衡15m in，磁力搅拌转速2000r/m in，GC解吸3m in为不变因素，分别改变加盐量、萃取温度和时间进行单因素实验。NaCl用量分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g/m L时，固定萃取温度30℃，萃取30m in。改变萃取温度为25、30、35、40℃时，固定加盐量为0.2g/m L，萃取30m in。在固定加盐量为0.2g/m L，萃取温度30℃时，分别萃取10、20、30、40、50m in。

1.2.3 萃取条件响应面优化设计 在单因素实验的基础上，以加盐量、萃取温度和萃取时间为影响因素，被检物质出峰面积为响应值[7-10]，运用Box-Benhnken中心组合实验设计原理进行响应面分析，确定HSSPME法萃取欧李发酵酒中香气成分的最佳萃取条件。实验设计中的水平及编码表见表1。

1.2.4 GC-FID分析条件 Agilent 7820A GC-FID，色谱柱为HP-INNOWAX（30m×0.25mm×0.25μm）；载气为：氮气，流速1m L/m in；升温程序：50℃保持2m in，以5℃/m in升到240℃，保持10m in；检测器（FID）：300℃；进样口温度：250℃；尾吹：25m L/m in；氢气流量：40m L/min，空气流量：400m L/min，不分流进样。

表1 Box-Behnken实验因素水平及编码Table1 The Box-Behnken experimental factors leveland coding

1.2.5 定性定量分析 根据标准样品色谱峰的保留时间与样品色谱峰的保留时间作对比进行定性；以仲辛醇为内标物，采用内标标准曲线法对各种香气成分进行定量[11-12]。

1.2.6 实验方法的验证和数据处理 实验中对优化的方法从回收率、线性范围、相对标准偏差等进行可行性的验证[13]。实验数据处理采用Design-expert 7.0统计软件进行回归分析[14]。

2 结果与分析

2.1 萃取条件的单因素实验

2.1.1 萃取头的选择 萃取头是固相微萃取技术的核心部分，其涂层材质对所分析的物质具有一定的选择性。本实验对DVB/Carboxen/PDMS和PDMS两种萃取头在相同实验条件下进行了优选，结果见图1。

由图1可知，萃取头的涂层不同所吸附的香气物质含量不同。DVB/Carboxen/PDMS萃取头比PDMS萃取头萃取出的香气物质含量总出峰面积高336%，可见DVB/Carboxen/PDMS对欧李发酵酒香气物质的吸附比PDMS更有效，更适于欧李酒香气组分得萃取。因此，以下的实验过程中均使用DVB/Carboxen/PDMS萃取头进行萃取。

2.1.2 加盐量的选择 在萃取过程中加盐可以提高离子强度，提高对目标物的萃取效率[15]。由于盐析作用，分析物的回收率提高，形成的水合球降低了可用于溶解分析物分子的水浓度，从而促使多余的分析物进入纤维涂层中。然而，与这一过程竞争的另一过程是分析物分子可能会与溶液中的盐离子发生静电作用，这样分析物进入纤维涂层的能力就降低了[16]。NaCl加入量对欧李发酵酒香气成分出峰面积的影响见图2。

图2 加盐量对萃取效果的影响Fig.2 The influence on extraction effectby salt concentration

由图2可见，加盐后香气物质的萃取效果明显增加，当加盐量为0.2g/m L时，出峰面积达到最大值。加盐量超过0.4g/m L，萃取效果变差。因此，最佳加盐量为0.2g/m L。

2.1.3 萃取温度的选择 萃取温度升高可以增加离子动能，显著缩短萃取时气液两项中物质达到平衡的时间，使整个分析过程加快。但是升温会带来两种截然相反的影响：从动力学角度看，SPME过程中温度的升高可以加大分析物的扩散系数，从而增加了分析物向涂层纤维的传质速率。而从热力学角度考虑，由于萃取过程是放热的，所以被萃取分析物的总量会随着温度的升高而降低[16-19]。从实践角度考虑，选择过高的萃取温度，针尖和样品之间的温差会导致水的凝结，这种现象会降低方法的精密度，偶尔也会使FID的火焰熄灭[20]。萃取温度对欧李发酵酒香气成分出峰面积的影响见图3。

图3 温度对萃取效果的影响Fig.3 The influence on extraction effectby temperature

从图3可以看出，在选定的温度范围内，随萃取温度升高，出峰面积呈先增加后减少的趋势，30℃时出峰面积达到最大值，高于30℃，萃取效果明显降低。因此，选择30℃进行萃取为宜。

2.1.4 萃取时间的选择 萃取时间过长会使易挥发性物质从纤维头上脱附，而萃取时间过短，一些物质尤其是高沸点的物质又来不及被萃取头吸附[21-22]。萃取时间对欧李发酵酒香气成分出峰面积的影响见图4。

图4 萃取时间对萃取效果的影响Fig.4 The influence on extraction effectby time

从图4可看出，在10～20m in，出峰面积随萃取时间的延长而增加，萃取30min时峰面积达到最大值，在30～40m in，出峰面积有所降低，在40～50m in，出峰面积又有所回升，这是因为随着萃取时间的延长，萃取头所吸附的被检物质有脱落现象和再吸附的现象，因此，有效萃取时间以30min为宜。

2.2 萃取条件的响应面优化分析

2.2.1 响应面法实验设计及结果 响应面法是利用合理的实验设计，采用多元二次回归方程拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法[23]。响应面法使得参数间的交互作用可通过有限次实验进行评估。响应面法目前已成为降低成本、优化加工条件的有效方法，广泛应用于农业、生物、食品、化学等领域[24]。

本实验在单因素实验基础上，利用Design Expert 7.0统计软件进行了实验设计与数据分析。根据Box-Benhnken中心组合实验设计原理，以加盐量、萃取温度、萃取时间为自变量，分别由A、B、C表示，以出峰面积为响应值进行回归分析。实验设计及结果见表2。

表2 响应面分析实验设计及结果Table2 The design and results of respond surface analysis

2.2.2 回归模型的建立及显著性检验 利用Design Expert 7.0软件对表2中实验数据进行回归分析，得到二次多元回归模型为：

对该模型的方差分析见表3。

由表3可知，模型p值0.0002，小于0.01，模型回归极显著；失拟项p值0.0969，大于0.05，失拟项不显著，因此模型成立。C、AB、A2、B2、C2项p值均小于0.01，为极显著；B和BC项p值均大于0.01而小于0.05，为显著；A和AC项p值均大于0.05，为不显著，说明线性项、二次项都有显著影响，各个实验因子对响应值的影响不是简单的线性关系，可以利用该回归模型来分析和预测HS-SPME萃取欧李酒中香气成分的最佳条件。其中复相关系数的平方R2=0.9672，校正复相关系数为0.9250，说明模型可以解释92.50%实验所得色谱峰面积的变化，表明方程拟合较好。CV（Y的变异系数）表示实验的精确度，CV值越高，实验的可靠性越低，本实验中CV=7.02%，较低，说明实验操作可信。回归方程为色谱峰面积变化提供了一个合适的模型。

2.2.3 萃取条件对萃取效果的影响 加盐量、萃取温度和萃取时间对被检物质出峰面积交互作用的响应曲面图见图5。

图5 响应面立体图Fig.5 The response surface stereogram

表3 回归模型方差分析Table3 ANOVA for response surface quadraticmodel

由图5（A）可知，随着萃取温度的升高，出峰面积呈迅速增加后减少的趋势；而随着加盐量的增加，出峰面积也呈迅速增加后略有减少趋势[18]。由图5（B）可知，随萃取时间延长，出峰面积呈迅速增加的趋势；而随加盐量的增加，出峰面积呈增加又减少的趋势。由图5（C）可知，随萃取温度升高，出峰面积呈先增加后减少的趋势；相对于萃取温度，萃取时间对出峰面积的影响较大，随着萃取时间的延长，出峰面积增加迅速。结合表3和图5可见，AB即加盐量和萃取温度的交互作用，对出峰面积的影响最大，为影响极显著的因素。

2.2.4 萃取条件的优化及验证实验 对显著因素水平的优化运用Design Expert 7.0软件对回归模型进行规范性分析，寻求最大出峰面积稳定点及对应的因素水平，结合回归方程的三维响应面图可知，回归模型存在稳定点，即最大值。当因素A、B、C取值分别为0.226g/m L、28.590℃、35.630min时，响应值Y达到最大值1.7384E+008，即出峰面积最大。考虑到实际应用过程中的可操作性，A、B、C的取值分别为：加盐量0.226g/m L、萃取温度29℃、萃取时间36m in。经验证实验证实，实际出峰面积为17186870，是预测值的98.87%，说明该模型可较好地反映欧李发酵酒香气物质检测时，顶空固相微萃取的条件[25-26]。

2.2.5 HS-SPME萃取欧李酒香气的气相色谱分析

图6 欧李酒样通过50/30μm DVB/Carboxen/PDMS萃取气相色谱图Fig.6 Chromatogram of a fruitwine extractobtained from Prunus humilis Bungewine by 50/30μm DVB/Carboxen/PDMS

以响应面法确定出的最优萃取条件对欧李发酵酒香气成分进行萃取，即取5m L欧李酒样加到20m L顶空萃取瓶中，加入0.226g/m L NaCl，在29℃下于磁力加热搅拌器上平衡15m in，磁力搅拌转速为2000r/m in，将DVB/Carboxen/PDMS萃取头插至液面上方，萃取36m in，GC解吸3m in。结合GC-FID分析，得到气相色谱图，共检测出32种香气物质。通过香气物质标准品保留时间与欧李发酵酒中香气成分的对比，对酒样中10种主要香气成分进行定性；用内标标准曲线法进行定量，检测时，向9个浓度梯度的标准溶液中均加入200μL仲辛醇为内标物（0.19848g/L），以待测组分的峰面积与内标物峰面积比值为纵坐标，待测组分的浓度与内标物浓度比值为横坐标作图，得到标准曲线，酒样检测时也加入相同量的内标物，然后用回归方程计算出各香气成分的含量，欧李发酵酒色谱分析图见图6，所定量的10种香气物质及含量分别为：异戊醇110.734mg/L、异丁醇8.7725mg/L、苯乙醇47.178mg/L、丙醇1.7032mg/L、己醇1.0042mg/L、己酸乙酯11.568mg/L、乙酸异戊酯15.655mg/L、乳酸乙酯1.7847mg/L、丁二酸二乙酯5.3988mg/L、己酸10.862mg/L，这10种物质的总量占测得32种香气物质含量的78.08%，其中异戊醇、苯乙醇含量较高。

2.3 固相微萃取方法的有效性验证

本研究考察了优化后的萃取方法分析欧李果酒中香气物质的可行性，包括方法的线性范围、回收率和相对标准偏差，分析结果见表4。

表4中，已定性出的10种物质线性范围为0.1～1mg/L至20～100mg/L，线性相关系数0.9863～0.9998。回收率的测定是在欧李酒中加入10种物质的混标溶液，10种物质的加入量分别为：异戊醇60.12mg/L、己酸乙酯24.60mg/L、异丁醇5.71mg/L、苯乙醇50.18mg/L、乙酸异戊酯7.16mg/L、丙醇3.04mg/L、乳酸乙酯3.44mg/L、丁二酸二乙酯9.07mg/L、己酸5.21mg/L、己醇2.10mg/L，按照加标回收率的计算方法得出回收率为80.48%～100.81%。相对标准偏差是3次重复测定后的结果，为3.24%～9.76%。

3 结论

本文对利用GC-FID检测欧李发酵酒时HSSPME方法进行了响应面优化，优化后的萃取条件为：加盐量0.226g/m L、萃取温度29℃、萃取时间36min。在优化条件下的验证实验，得到出峰面积实测值为17186870，是预测值的98.87%，说明响应面分析所得优化模型是可靠的。从线性范围、回收率、相对标准偏差等对检测方法的可行性验证，可知该方法是一种快速、准确的分析方法[27]。

表4 顶空固相微萃取对欧李酒样品香气成分GC-FID分析结果（n=3）Table4 The analysis results of aroma components in Prunus humilis Bunge wine by HS-SPME combined with GC-FID（n=3）

以优化所得HS-SPME条件，结合GC-FID检测出欧李发酵酒中32种香气物质，对其中10种进行了定性和定量分析，分别为异戊醇110.734mg/L、异丁醇8.7725mg/L、苯乙醇47.178mg/L、丙醇1.7032mg/L、己醇1.0042mg/L、己酸乙酯11.568mg/L、乙酸异戊酯15.655mg/L、乳酸乙酯1.7847mg/L、丁二酸二乙酯5.3988mg/L、己酸10.862mg/L，这10种物质的总量占测得32种香气物质含量的78.08%，其中异戊醇、苯乙醇含量较高，体现了欧李发酵酒独特的风味[28]。

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