LC-MS/MS法测定比格犬血浆中的阿那曲唑

陈 真赵瀛兰晏菊芳

（1.四川大学生物治疗国家重点实验室，四川 成都 610041；2.四川海思科制药有限公司，四川 成都 611130）

LC-MS/MS法测定比格犬血浆中的阿那曲唑

陈 真1，2，赵瀛兰1，晏菊芳2

（1.四川大学生物治疗国家重点实验室，四川 成都 610041；2.四川海思科制药有限公司，四川 成都 611130）

用高效液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定比格犬血浆中阿那曲唑的浓度。以苯磺酸氨氯地平为内标，加入50μL血浆，用甲基叔丁基醚萃取后取上清液以氮气吹干，用50%甲醇水溶液复溶，进样5μL，在电喷雾离子源下进行正离子检测。色谱柱为Agilent XDB C18（50mm×2.1mm×3.5μm），流动相为0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈（60∶40）。阿那曲唑和内标的质荷比（m/z）分别为294.4和409，阿那曲唑和内标生成的主要碎片离子的质荷比（m/z）分别为255.3和238。阿那曲唑在0.5～500ng·mL-1内线性良好，检出限为0.5ng·mL-1，提取回收率均大于80%，日内、日间准确度为101%～104%，日内、日间精密度分别小于7.04%和8.69%，已成功检测比格犬血浆中阿那曲唑的血药浓度。所用方法稳定、灵敏度好、分析时间短、提取回收率高，适用于比格犬血浆中阿那曲唑的血药浓度测定。

阿那曲唑；液质联用；血药浓度；液液萃取

0 引言

阿那曲唑是一种强效、高选择性的非甾体类芳香化酶抑制剂，临床上广泛应用于绝经后妇女晚期乳腺癌的治疗。绝经后妇女雌激素主要由外周组织中肾上腺雄激素经芳香酶作用转化而来，芳香酶是一种CYP45O复合酶，可氧化脱去C19类固醇（雄烯二酮和睾酮）的19-甲基，使A环芳香化，从而转变成C19雌激素（雌酮和雌二醇）。绝大多数乳腺癌病人体内雌激素受体呈阳性，肿瘤在雌激素刺激下生

长。阿那曲唑具有高度选择性，能有效抑制此酶的活性，充分阻断绝经后妇女内源性雌激素的合成，降低体循环内雌激素水平，有效阻滞肿瘤生长，甚至导致癌细胞死亡[1]。由于该药口服剂量小，血浆中药物浓度很低且干扰物质多，所以对其血药浓度分析方法的检测灵敏度和选择性要求较高。文献报道的有关阿那曲唑的血药浓度检测方法有HPLC-RIA法[2]、气相色谱-电子捕获法[3]和高效液相色谱串联质谱法[4-5]，皆为以人血浆或组织为基质建立的分析方法，且基质用量大，不适用于比格犬药代动力学实验血浆样品的高通量分析。本研究建立了快速、灵敏、特异的LC-MS/MS法，用于测定比格犬血浆中的阿那曲唑，达到“化学药物非临床药代动力学研究技术指导原则”中对于生物样品分析方法的要求，为研究该药在比格犬体内的药代动力学特点提供可靠的分析方法。

1 实验部分

1.1 仪器、试药与动物

LC-20AD高效液相色谱仪（日本岛津）；API3200三重四极杆质谱仪（美国AB SCIEX）；5804R低温高速离心机（德国艾本德）；XS105分析天平（梅特勒托利多）；D11931纯水仪（美国热电）；MTN-2800W氮吹仪（天津奥特赛恩斯）。瑞宁德阿那曲唑片（阿斯利康制药有限公司，批号：WB0130，每片含1mg阿那曲唑）；阿那曲唑对照品（上海宇亨医药科技，批号：F0H034，纯度99.9%，USP）；内标苯磺酸氨氯地平（中国食品药品检定研究院，批号：100825-200501）；乙腈、甲醇、甲酸为色谱纯；水为超纯水；甲基叔丁基醚为分析纯；空白比格犬血浆为肝素钠抗凝。雄性比格犬（四川省医学科学院实验动物研究所，合格证号：SCXK（Chuan）2006-024）6只，体重5～8kg。

1.2 方法与结果

（1）溶液的配制。精密称取10mg阿那曲唑，加入10mL甲醇，配成1mg·mL-1的贮备液。临用时以甲醇将贮备液稀释至以下浓度：5，10，50，100，200，500，1000，2000，5000ng·mL-1，即为所需标准品溶液。精密称取10mg苯磺酸氨氯地平，加入10mL甲醇，配成1mg·mL-1的内标贮备液，精密吸取300μL 1mg·mL-1内标贮备液，以甲醇定容至10mL，配成30μg·mL-1的内标中间溶液，再吸取1mL 30μg·mL-1中间溶液，加入9mL甲醇，即为3μg·mL-1的内标溶液。标准储备液及内标溶液均置4℃下保存。

（2）色谱条件。采用Agilent Zorbax，XDB C18色谱柱（50mm×2.1mm×3.5μm），流动相为0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈（60∶40，v/v），流速0.4 mL·min-1，柱温35℃，进样量5 μL。采用电喷雾离子源，以多反应监测（MRM）模式进行正离子检测，阿那曲唑m/z294.4→225.3，去簇电压（DP）45V，射入电压（EP）5V，碰撞能量（CE）29 V，碰撞室出口电压（CXP）5 V；内标m/z409→238，去簇电压（DP）30V，射入电压（EP）3.1V，碰撞能量（CE）23V，碰撞室出口电压（CXP）4V，阿那曲唑的出峰时间约1.1 min，内标的出峰时间约0.8min，色谱运行时间3min。

（3）血浆样品前处理。吸取50 μL空白血浆或样本至1.5mL离心管中，加入5μL“（1）”项标准品溶液（标准曲线样品）或甲醇（待测血样），加入5 μL 3 μg·mL-1的内标溶液，充分混匀，再加入500μL甲基叔丁基醚，漩涡混匀2min，于4℃、2250g·min-1离心10 min，吸取上清液400 μL，氮气吹干，残留物用100μL 50%甲醇复溶，于4℃、2250g·min-1离心10min后，取5μL上清液进样。

（4）方法专属性。分别取6只比格犬的空白血浆，不加内标溶液（以等体积甲醇补足），其余按“（3）”项方法处理后进样检测；取对照品溶液按“（3）”项方法处理，阿那曲唑和内标的保留时间约为1.1min、0.8min；取给药后2h收集的血浆样品同法操作。结果表明，样品中内源性物质不干扰阿那曲唑和内标的测定。色谱图见图1。

（5）标准曲线、线性范围及检出限。取50μL空白血浆，加5 μL“（1）”项标准品溶液，分别配成相当于含阿那曲唑0.5，1，5，10，20，50，100，200，500ng·mL-1的血浆样品。按“（3）”项方法处理，进样5 μL，记录色谱图。以阿那曲唑的浓度为横坐标、阿那曲唑与内标的峰面积比值为纵坐标绘制标准曲线，用加权（W=1/x2）最小二乘法进行回归运算，得到回归方程：Y=0.040 8X+0.0041（r=0.998 1）。阿那曲唑的线性范围为0.5～500 ng·mL-1，检出限为0.5ng·mL-1。

（6）基质效应。取50μL空白血浆，按“（3）”项操作制备18份提取后的空白样品，取400 μL上清液，分别加入低、中、高浓度质控溶液（15，400，4 000 ng·mL-1）和内标溶液各5 μL，氮气吹干后，以50%甲醇复溶至100μL，进样并记录色谱峰面积。与相应同浓度的6份标准溶液结果比较，以二者的峰面积比值计算其基质效应。低、中、高浓度及内标的基质效应分别为89.2%±3.18%、92.3%±5.79%、90.8%±3.93%、91.6%± 4.17%，比值均在85%～115%，RSD＜15%，基质效应对检测结果影响较小。

图1 空白血浆（A）、空白血浆+对照品+内标（B）、血样（C）溶液中阿那曲唑（1）及内标（2）的专属性色谱图

（7）提取回收率。取50μL空白血浆，分别加入低、中、高浓度质控溶液和内标溶液各5 μL，得到1.5，40，400ng·mL-1的质控样本，每个浓度质控样本制备6份，按“（3）”项处理，进样并记录色谱峰面积。与“（6）”项相应同浓度的6份空白血浆提取后加入质控溶液的样本相比较，以二者的峰面积比值计算提取回收率。结果低、中、高浓度及内标的提取回收率分别为83.0%±2.38%、81.9%±4.96%、83.7%±4.23%、85.4%±4.52%，RSD＜15%。将18份低、中、高浓度质控样品的阿那曲唑/内标峰面积比代入当日的工作标准曲线计算，得低、中、高浓度的方法回收率分别为104%±6.78%、101%±7.14%、102%±2.25%。

（8）精密度和准确度。取50μL空白血浆，按“（3）”项方法配制低、中、高浓度的质控样品，每个浓度质控样本各6份，连续测定3 d，计算日内及日间精密度和准确度，见表1。

（9）稳定性试验。标准品储备液在2～8℃避光条件下稳定，至少可储存35d。阿那曲唑低、中、高浓度样品在室温下放置6.5 h，提取后在4℃放置4 d，反复冻融3个循环，在-80℃保存34d的稳定性皆较好，变化均＜15%，该化合物及分析方法的稳定性较好，能满足实验要求。

表1 LC-MS/MS测定比格犬血浆中阿那曲唑的准确度和精密度

（10）药动学参数。6只雄性成年比格犬，禁食过夜，经口给药，给药剂量为1mg/只，于给药前（0h）和给药后1，2，4，8，12，24h由前肢头静脉取血，每次取血2mL，置肝素钠真空采血管中，离心后分离血浆，于-80℃保存。待测血浆样品按“（3）”项方法进行前处理，以当天工作标准曲线进行计算，同时分析低、中、高浓度的质控样品（各浓度不少于两个），记录样本的阿那曲唑/内标峰面积比，根据回归方程计算每个血浆样本的药物浓度。比格犬体内阿那曲唑的血药浓度-时间曲线见图2。以DAS（V 2.0）软件分析药代动力学参数，得到 Cmax为37.27±8.21μg·L-1、AUC0-t为454.19±55.21 μg·h·L-1、 MRT0-t为 8.42±0.58为 8.58±1.95 h、Tmax为 1.17±0.41 h、CLz/F为1.91±0.32 L·h-1、Vz/F为23.15± 3.30L。

Determination of anastrozole in beagle dog plasma by LC-MS/MS

CHEN Zhen1，2，ZHAO Ying-lan1，YAN Ju-fang2
（1.State Key Laboratory of Biotherapy，Sichuan University，Chengdu 610041，China；2.Sichuan Haisco Pharmaceutical CO.，Ltd，Chengdu 611130，China）

The HPLC-tandem mass spectrometry method（LC-MS/MS）was developed for the determination of anastrozole concentration in beagle dog plasma.50μL plasma samples were mixed with MTBE followed by extraction，the supernatant was dried under N2and re-dissolved by 50% methanol，and 5 μL of which was injected onto LC-MS/MS.The analysis was carried out under the positive mode of electronic-spray ionization（ESI）.Chromatographic column was Agilent XDB C18（50mm×2.1mm×3.5μm），mobile phase was 0.1%formic acid in water-0.1%formic acid in acetonitrile（60∶40）.The mass-to-charge ratio（m/z）of anastrozole and internal standard were 294.4-225.3 and 409-238， respectively.The linear range ofanastrozole was within the concentration of 0.5-500 ng·mL-1.The LOD was 0.5 ng·mL-1.The extraction recoveries were all higher than 80%.The intra-and inter-day accuracy were 101%-104%，the intra-and inter-day precisions（RSD）were less than 7.04%and 8.69%，respectively.The anastrozole concentration in beagle dog plasma was detected successfully.The method was stable，sensitive，speedy and highly recovered.It was suitable for determining the anastrozole concentration in beagle dog plasma.

anastrozole；LC-MS/MS；plasma concentration；LLE

R917；S829.2；R331.1；O657.7+2

：A

：1674-5124（2014）01-0059-03

10.11857/j.issn.1674-5124.2014.01.016

2013-02-16；

：2013-04-07

陈 真（1981-），女，四川成都市人，助理工程师，硕士，研究方向为制药工程。