酶促乙酯化和分子蒸馏联用制备高DHA乙酯的工艺

孙兆敏，张 芹，郭正霞，王静凤，李兆杰，薛 勇，王玉明，薛长湖（中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛266003）

酶促乙酯化和分子蒸馏联用制备高DHA乙酯的工艺

孙兆敏，张 芹，郭正霞，王静凤，李兆杰，薛 勇，王玉明，薛长湖*
（中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛266003）

利用固定化脂肪酶催化乙酯化反应将裂殖壶菌总脂转化为乙酯，并借助分子蒸馏手段制备得到了高DHA含量的乙酯产品。实验考察了反应温度、时间、底物质量配比和脂肪酶添加量等参数对酶促乙酯化反应的影响。在较优条件下（反应温度40℃，反应时间24h，底物质量比10∶2，Lipozyme 435添加量为油脂质量的6%），固定化脂肪酶的操作稳定性良好。采用分子蒸馏技术富集酶促醇解所得裂殖壶菌乙酯中的DHA，可得到DHA含量高于80%的乙酯产品，通过多级分子蒸馏和将轻相组分回流的方式可以显著提高DHA含量乙酯的得率。

裂殖壶菌，乙酯化，分子蒸馏，DHA

二十二碳六烯酸（DHA）是一种重要的n-3多不饱和脂肪酸（n-3 PUFA），它是婴幼儿的生长发育和维持大脑的正常认知功能不可或缺的物质[1]。裂殖壶菌（Schizochytrium sp.）是目前工业发酵制备DHA的理想菌种之一，其产生的油脂可达细胞干重的70%以上，而DHA的含量则多在35%～45%范围内[2]，是制备高含量DHA产品的优良原料。

脂肪酸乙酯或甲酯的制备通常采用化学法，即采用碱性化合物（如LiOH、NaOH、CH3ONa等）[3-7]为催化剂在高温条件反应，反应过程易引起中性脂的皂化、产物不易于分离纯化且产生大量污染环境的废弃物；以脂肪酶作为催化剂的反应具有反应条件温和、效率高和产物易于分离纯化等优点[8]。目前利用脂肪酶催乙酯化反应的研究多集中在生物柴油[9-11]和富含n-3PUFA的甘油酯的酶法制备[12-13]方面。分子蒸馏技术可在远低于物料沸点的温度条件下进行分离，蒸馏压力低，受热时间短，特别适于高沸点、易氧化、热敏性物质的分离，且不涉及对环境有害的废弃物的排放，目前该技术已经应用于维生素E、单甘油酯、L-乳酸等的提取和精制以及n-3 PUFA的富集等领域[14-16]。

本研究拟采用固定化脂肪酶为催化剂，催化裂殖壶菌总脂与乙醇的醇解反应制备含DHA的乙酯，并通过分子蒸馏法进一步富集乙酯中的DHA，得到高DHA含量的乙酯产品。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

裂殖壶菌（Schizochytrium sp.）干粉 厦门汇盛生物有限公司；固定化脂肪酶Lipozyme 435（活力为76.33U/g） 天津诺维信公司。

6890N气相色谱仪、1100型液相色谱仪 美国Agilent公司；ELSD2000型蒸发光散射检测器 美国Alltech公司；KDL-1型分子蒸馏设备 德国UIC公司；Laborota4000型旋转蒸发仪 德国Heidolph公司。

1.2 实验方法

1.2.1 裂殖壶菌总脂的提取 称取500g裂殖壶菌干粉加入1.5L氯仿-甲醇混合液（2∶1，V/V）搅拌提取30min，抽滤得到滤液减压浓缩至1.0L后加入5%NaCl溶液400mL充分振荡，静置分层取下层氯仿相，过无水硫酸钠脱水后于45℃、-0.08MPa条件下旋转蒸发脱除氯仿，得到黄色裂殖壶菌总脂。

1.2.2 裂殖壶菌总脂的酶促乙酯化 称取裂殖壶菌总脂、无水乙醇以及固定化脂肪酶Lipozyme 435加入具塞三角瓶中，充氮气后密封，置于振荡水浴摇床中分别在不同温度下反应一定时间。反应完毕后过滤取滤液于60℃、-0.08MPa条件下旋转蒸发脱除未反应的乙醇，取样溶于正己烷-异丙醇混合液（1∶1，V/V），液相色谱法测定其脂质组成，计算酯化率。

1.2.3 裂殖壶菌乙酯的分子蒸馏 将酶促乙酯化制备得到的裂殖壶菌乙酯产物经水洗、脱色、脱水后进行分子蒸馏。首先在不同蒸馏温度下进行单级分子蒸馏，收集重相组分分析其脂肪酸组成，再进行多级分子蒸馏制备高DHA含量的乙酯产品，单级分子蒸馏和多级分子蒸馏各级蒸馏单元的刮片转速为170r/min，蒸馏压力为0.1Pa，进料速度为4mL/min，其高DHA乙酯得率即为分子蒸馏重相组分占进料量的百分比。

1.2.4 脂质组成测定 反应混合物的脂质组成测定采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器联用（HPLCELSD）的方法[17]，其条件如下：a.色谱条件：液相色谱仪为Agilent1100型液相色谱仪；流动相采用正己烷-异丙醇-乙酸（90∶10∶0.2，V/V/V），流速为0.8mL/min，每个样品分析时间为12min；分析柱选用Rx-SIL型正相硅胶色谱柱，柱温35℃；b.ELSD条件：以99.9%氮气为雾化气，流量为1.4L/min；撞击器处于关闭模式；漂移管温度为60℃。根据计算机采集的数据进行积分计算各组分峰面积，代入标准曲线计算各组分在样品中的质量，计算各组分在反应混合物中的含量，酯化率（ED）和DHA酯化率（ED of DHA）的计算公式如下：

式中：m（EE）—样品中乙酯（EE）的质量，mg；m’（EE）—理论上裂殖壶菌总脂能转化成的EE质量，mg；A—一定反应时间EE中DHA的含量，%；A’—裂殖壶菌总脂中DHA的含量，%。

1.2.5 脂肪酸组成测定 脂肪酸组成的测定采用气相色谱法，其样品衍生和检测条件如下：a.反应混合物的甲酯化：取约10μL样品点样于硅胶G薄层色谱板上，于正己烷-乙醚-乙酸（85∶15∶1，V/V）体系中展开，硅胶板挥干溶剂后碘缸略微显色，刮下各条带于10mL具塞试管中，加入10%H2SO4-甲醇溶液1mL后于60℃水浴加热15min，之后加入0.4mL正己烷充分振荡，静置分层，取正己烷层脱水过膜后密封冷藏待测。b.气相色谱条件条件：进样口温度为250℃，分流比为20∶1；分析柱选用HP-INNOWax石英毛细管柱（30m×0.32mm×0.25μm），采用梯度升温，初始温度为170℃，以3℃/min升温至210℃并保持13min，其载气（高纯氮气）流速为1mL/min；检测器为火焰离子化检测器（FID），检测器温度280℃。

2 结果与讨论

2.1 裂殖壶菌总脂脂肪酸测定

裂殖壶菌干粉经氯仿-甲醇法提取总脂后，采用气相色谱法测定了其脂肪酸组成。实验选用的裂殖壶菌干粉总脂中的脂肪酸组成较为简单，主要含有六种脂肪酸，分别为：23.89%C16∶0、2.33%C18∶0、6.27%C18∶1、16.94%C18∶2、8.69%C22∶5 n-6和41.69% C22∶6 n-3（DHA），包括了饱和脂肪酸（26.22%）、单不饱和脂肪酸（6.27%）和多不饱和脂肪酸（67.32%）。

图1 裂殖壶菌总脂脂肪酸气相色谱图Fig.1 The GC chromatogram of fatty acids in total lipids of Schizochytrium sp.

图2 反应温度对酶促乙酯化反应的影响Fig.2 Effect of temperature on enzymatic ethylation

2.2 温度对酶促乙酯化的影响

温度能够改变反应体系的黏度和酶的活力。随着温度的升高，反应体系的黏度下降，反应底物和产物的传质效率得到提高，在一定的温度范围内，酶活力随温度的升高而提高，但过高的温度则会引起酶蛋白的变性失活。实验在底物质量比（裂殖壶菌总脂与无水乙醇的质量比）为10∶3、固定化脂肪酶添加量3%、反应时间24h的条件下，选取了30、40、50、60℃四个温度来考察温度对酶促乙酯化反应的影响。由图2可知，在30℃的温度条件下，反应的乙酯化率和DHA酯化率分别为59.19%和45.90%；提高温度至40℃，乙酯化率、乙酯中DHA的含量和DHA酯化率都达到最高；提高温度至50℃和60℃，Lipozyme 435的催化效率甚至低于30℃的反应结果，可能原因是极性较强的乙醇和高温的共同作用导致酶活力的降低。根据以上的实验结果，选用40℃作为后续研究的温度条件。

2.3 反应时间对酶促乙酯化的影响

实验在反应温度40℃、底物质量比10∶3、固定化脂肪酶添加量3%的条件下，于不同反应时间取样测定其脂质组成和各组分的脂肪酸组成，以考察反应时间对酶促乙酯化反应的影响，其结果如图3所示。反应初期的底物浓度高，反应速度较快。在所选的实验条件下反应2h，裂殖壶菌总脂的酯化率和DHA酯化率分别达到25.00%和12.38%，当反应至4h时，酯化率和DHA酯化率分别为39.59%和22.31%，与前2h相比反应速度有所降低，由于底物的消耗，4h后的反应速度进一步降低，当反应至12h时，酯化率和DHA酯化率分别达到63.46%和45.10%，而反应时间为24h时基本达到平衡，因此选取24h作为后续研究的反应时间。

图3 反应时间对酶促乙酯化反应的影响Fig.3 Effect of reaction time on enzymatic ethylation

图3 所示DHA酯化率的曲线在反应过程中一直低于酯化率的曲线，表明裂殖壶菌总脂中的DHA酯化率一直低于总脂肪酸的酯化率，说明Lipozyme 435在反应过程中可能优先催化饱和脂肪酸和低不饱和度的脂肪酸参与乙酯化反应，表现出一定的脂肪酸选择性，相同的结论也可以通过图3中乙酯的DHA含量随反应时间的变化曲线得出。

2.4 底物质量比对酶促乙酯化的影响

实验在反应温度40℃、反应时间24h、脂肪酶添加量3%的条件下，考察了底物质量比对酶促乙酯化反应的影响。由图4可知，当底物质量比为10∶1时，乙醇的添加量在理论上不足以使裂殖壶菌总脂完全反应，在实验所选的条件下反应24h，其酯化率和DHA酯化率分别为49.47%和52.60%；底物质量比为10∶2时，酯化率和DHA酯化率为最高，分别为86.72%和87.42%；之后随着底物质量比的降低（乙醇添加量的增加），酯化率和DHA酯化率逐渐降低，且底物比为10∶8和10∶10的时候，乙酯化反应结果基本相同。由于乙醇和甘油三酯难于互溶，降低底物质量比（即反应体系中乙醇量的增加），其直接的结果是影响反应底物的混合以及固定化酶在反应体系的均匀分布，从而降低脂肪酶的催化效率；由于乙醇的极性较强，向反应体系中加入过高的乙醇不利于酶活力稳定性的保持[18-21]。实验所选取的最优底物质量比为10∶2，在反应开始之前，反应体系呈微乳状，脂肪酶催化醇解反应产生脂肪酸乙酯、甘油二酯和单甘油酯等产物，其中脂肪酸乙酯可与乙醇互溶，而甘油二酯和单甘油酯存在羟基基团，其对乙醇的溶解性大大增强，乙酯化反应30min，反应混合物即可互溶成为均一透明的液体（数据未列出），而增加酶量则可能更利于加快该进程。另外，乙酯中的DHA含量随底物质量比的降低而降低，说明反应体系中乙醇量的增加会导致DHA在甘油酯中的富集。

图4 底物质量比对酶促乙酯化反应的影响Fig.4 Effect of substrate ratio on enzymatic ethylation

2.5 脂肪酶添加量对酶促乙酯化的影响

为考察脂肪酶添加量对酶促乙酯化反应的影响，在反应温度40℃、底物质量比10∶2条件下，选取1%、2%、3%、4%、6%、8%和10%七个脂肪酶添加量进行实验，反应24h后测定乙酯化指标，结果如图5所示。脂肪酶的添加量小于4%时，乙酯中DHA的含量随酶量的增加而缓慢提高，直到脂肪酶添加量增加到4%，乙酯中DHA的含量达到与原料裂殖壶菌总脂相同的水平，继续增加酶量至6%，DHA酯化率不再低于乙酯化率，二者均接近100%。脂肪酶添加量较低时，乙酯化率和DHA酯化率较低的原因之一可能是反应产生甘油对固定化酶的包裹作用，加大酶量可能在一定程度上“稀释”了这种包裹作用。根据以上的结果，选择脂肪酶添加量6%进行后续研究。

图5 酶添加量对酶促乙酯化反应的影响Fig.5 Effect of enzyme dosage on enzymatic ethylation

2.6 固定化酶的重复利用

随着酶促乙酯化反应的进行，当甘油骨架上的脂肪酸被完全乙酯化后，反应体系中，甘油黏度和密度高，且不溶于反应体系，易于包裹固定化酶颗粒阻碍底物与固定化酶的接触，从而阻碍反应的进行。Shimada等[22]在考察脂肪酶的操作稳定性时，发现甘油积累在固定化酶表面，需要定时用溶剂清洗。

由于实验选用的脂肪酶添加量较大，可在一定程度上减小甘油对固定化酶的包裹作用，实验在如下条件进行以考察固定化酶的操作稳定性：底物质量比10∶2，Lipozyme 435添加量为油脂质量的6%，反应温度40℃，反应时间24h。每一批反应完毕后过滤，固定化酶经叔丁醇洗涤后直接加入新配制的底物混合液中进行下一次反应，实验共进行20次，其结果如图6所示。

图6 固定化脂肪酶的重复利用Fig.6 The reuse of immobilized lipase

由图6可知，经过20批次的反应，在所选的条件下反应24h，酯化率和DHA酯化率没有明显的降低，其酯化率和DHA酯化率分别为98.44%和97.95%。将20批次反应所得油脂混合物合并，经5%NaCl溶液洗涤三次后脱水过0.45μm有机膜，得到黄色的乙酯产品，其DHA含量为40.91%。

2.7 裂殖壶菌乙酯的分子蒸馏

在刮片转速170r/min、蒸馏压力0.1Pa、进料速度4mL/min的条件下，将酶促乙酯化所得裂殖壶菌乙酯于不同温度进行单级分子蒸馏，收集重相组分测定脂肪酸组成，所得结果如图7所示。

图7 温度对分子蒸馏重相脂肪酸组成的影响Fig.7 Effect of temperature on the fatty acid composition of heavy fractions of molecular distillation

在80～130℃范围内，随着蒸馏温度的升高，重相组分中DHA含量不断提高，当温度达到130℃时，重相中DHA和C22∶5n-6含量达到81.72%和15.86%，由于两种脂肪酸乙酯的分子自由程差异较小，在实验室条件下无法通过提高温度进一步提高DHA的含量，当提高蒸馏温度至140℃时，裂殖壶菌乙酯全部成为轻相。

图8 三级分子蒸馏重相脂肪酸组成气相色谱图Fig.8 The GC chromatogram of fatty acids in heavy fraction of three-stage procedure of molecular distillation

表1 六级分子蒸馏结果（90℃-90℃-100℃-100℃-110℃-110℃）Table 1 Results of six-stage procedure（90℃-90℃-100℃-100℃-110℃-110℃）of molecular distillation

表2 三级分子蒸馏结果（100℃-100℃-110℃）Table 2 Results of three-stage procedure（100℃-100℃-110℃）of molecular distillation

虽然采用单级分子蒸馏在130℃条件下可得到DHA含量在80%以上的乙酯产品，但高DHA乙酯得率较低（仅21.19%）。通过多级分子蒸馏不仅可以提高最终产品的得率，还能在得到相同DHA含量的产品的前提下，降低蒸馏温度。多级分子蒸馏首先在较低的温度下进行分子蒸馏，收集重相组分于下一级温度条件进行蒸馏，多级分子蒸馏的刮片转速、蒸馏压力和进料速度均与单级分子蒸馏相同。表1和表2分别是采用六级分子蒸馏和三级分子蒸馏富集DHA乙酯的结果。比较可知，在三级分子蒸馏过程中，每级重相中DHA含量都低于六级分子蒸馏时相同温度下所得到的重相中DHA含量，最终产品中DHA的含量仅比六级分子蒸馏低0.66%。

六级和三级分子蒸馏最终高DHA乙酯的得率分别增加到30.96%和33.12%。在多级分子蒸馏的升温过程中，轻相组分中的DHA含量随蒸馏温度的升高而增加，六级分子蒸馏所得轻相组分中DHA的含量依次为0%、2.61%、23.94%、39.95%、59.99%和73.37%，而三级分子蒸馏所得轻相组分中DHA的含量依次为7.10%、19.14%和47.84%，在多级分子蒸馏过程中，将高DHA含量的轻相组分回流继续进行蒸馏，可进一步提高产品的得率，如将六级分子蒸馏中第四级轻相与第一级的进料混合，将第五级轻相与第二级的进料混合，将第六级轻相与第三级进料混合，可将六级分子蒸馏的产品得率由30.96%提高至36.45%。

3 结论

利用脂肪酶催化乙酯化反应将含40%以上DHA的裂殖壶菌总脂转化为乙酯，并借助分子蒸馏手段制备得到DHA含量高于80%的乙酯产品。采用固定化脂肪酶为催化剂可将裂殖壶菌总脂转化为乙酯，相对于化学法，该法具有条件温和、不产生废弃物和产物易于分离纯化等优点。在所得较优反应条件下（反应温度40℃，反应时间24h，底物质量比10∶2，Lipozyme 435添加量为油脂质量的6%），固定化脂肪酶的操作稳定性良好，反应20批次裂殖壶菌总脂酯化率未出现明显降低。分子蒸馏可有效地富集酶促乙酯化所得乙酯中的DHA，而多级分子蒸馏和将较高DHA含量的轻相组分回流继续进行蒸馏，可提高高DHA含量产品的得率。

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Preparation of ethyl esters highly enriched in DHA via enzymatic ethylation and molecular distillation

SUN Zhao-min，ZHANG Qin，GUO Zheng-xia，WANG Jing-feng，LI Zhao-jie，XUE Yong，WANG Yu-ming，XUE Chang-hu*
（College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

In the present study，the total lipids from Schizochytrium sp.were ethylated by immobilized lipase and ethyl esters highly enriched in C22∶6 n-3（DHA）was obtained through molecular distillation.The effect of temperature，reaction time，substrate ratio，and enzyme dosage on enzymatic ethylation was investigated.Under optimum reaction conditions（reaction temperature 40℃，reaction time 24h，substrate ratio 10∶2，Lipozyme 435 dosage 6%），immobilized lipase had good operational stability.Ethyl esters with no less than 80%DHA was obtained via molecular distillation，and the yield of DHA ethyl esters could be significantly improved by multistage molecular distillation and recycle of light fractions.

Schizochytrium sp.；ethylation；molecular distillation；DHA

TS225.6

A

1002-0306（2014）12-0167-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.027

2013－09－24 *通讯联系人

孙兆敏（1983-），男，博士，研究方向：水产化学。

“泰山学者”建设工程专项经费；长江学者和创新团队发展计划资助；海洋公益性行业专项（201105029）；国际科技合作项目（2010DFA31330）；山东省科技发展计划（2012G0021506）。